[发明专利]诺西肽生物合成控蛋白NosP的特异性结合序列及相关应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物次生代谢产物生物合成途径调控领域，具体涉及特异性调控蛋白NosP在硫肽类抗生素诺西肽生物合成基因簇中特异性结合DNA序列的发现和验证，以及通过NosP提高诺西肽在活跃链霉菌中生物合成效价的实际应用。

背景技术

诺西肽(Nosiheptide)，又称多硫霉素，是由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus ATCC 25421)产生的一种典型硫肽类抗生素，是最早被发现并投入使用的硫肽类抗生素之一。诺西肽对革兰氏阳性菌具有广谱而强效的抑制作用，尤其是一些耐药菌如金黄色葡萄球菌具有强力的杀伤作用。但由于其产量低、水溶性差、生物利用度低，目前只作为添加剂被用于动物饲料中[McGinnis C,Poult Sci,1978,57(6):1641-1645.]。诺西肽属于e类硫肽类抗生素，由12个氨基酸及其衍生物组成。它的结构已于1977年被鉴定[Prange T,et al,Nature,1977,265(5590):189-190.]，主要由2部分构成：骨架部分由5个噻唑环，1个吡啶环构成；侧链部分由3-甲基-5-甲氧基-2-吲哚酸构成；骨架部分与侧链之间通过硫脂键相连。

链霉菌中抗生素的合成和链霉菌的生长过程密切相关，受到多层次的复杂调控，这些调控途径的核心参与者常为蛋白质类的调控因子，按照调控因子发挥作用的范围可粗略地将其分为2大类：全局性调控因子(global regulator)和途径特异性调控因子(pathway-specific regulator)。对抗生素合成的第一层次的调控来源于全局性调控因子(global regulators)，第二层次的调控来源于途径特异性调控因子。途径特异性调控因子通常位于某种抗生素基因簇中，主要对生物合成基因簇内部基因具有特异性调控作用的调控因子。途径特异性调控因子多数属于SARP(Streptomyces antibiotic regulatory Protein)家族[Wietzorrek A,et al,Mol Microbiol,1997,25(6):1181-1184.]，常充当信号级联系统中的最后一级效应蛋白，专一性地激活一个或几个抗生素基因簇的转录[Martin JF,et al,J Ind Microbiol,1992,9(2):73-90.]，可对抗生素的生物合成效价产生较强的影响。

2009年，中科院上海有机所的刘文教授课题组成功钓取并测定了活跃链霉菌(Streptomyces actuosus ATCC 25421)中约35kb的诺西肽生物合成基因簇序列[Pascard C,et al,J Am Chem Soc,1977,99(19):6418-6423.]，为诺西肽生物合成途径的研究创造了便利的条件。生物信息学分析显示，nosP基因位于S.actuosus诺西肽生物合成基因簇一端，推测NosP蛋白属于SARP家族，参与诺西肽生物合成途径特异性调控，但其具体结合的DNA序列以及 对诺西肽生物合成效价的影响均属未知。

通常SARP家族途径特异性调控蛋白可通过与生物合成基因簇中特定的DNA序列结合，对抗生素合成相关基因的转录起到重要的调节作用，进而影响抗生素的最终发酵产量。因此NosP结合DNA序列的发现和验证为通过遗传操作技术手段理性改造诺西肽生物合成途径，提高诺西肽生物合成效价提供了理论和物质基础，对增加工业化生产诺西肽的经济性和可行性具有广泛的实用价值和重要意义。

发明内容

本发明的发明目的是寻找和验证诺西肽生物合成途径中途径特异性调控蛋白NosP的结合DNA序列，改造诺西肽生物合成基因簇，提高诺西肽的生物合成效价和发酵产量，在此基础之上，通过萃取-结晶方法进一步简化诺西肽生产工艺和降低生产成本。

为达到上述发明目的，本发明采用了的技术方案包括以下发明内容：

(1)构建含截短nosP基因的重组表达质粒，并在蛋白质的N端或C端添加纯化标签组氨酸标签、GST、MBP中的任意一种，优选组氨酸标签；

(2)优化NosP的表达条件：37℃下将工程菌振摇培养至培养液OD600＝0.8±0.1后，加入0.001-2mM的诱导剂IPTG，并优选出最佳浓度0.2mM，在10～37℃下诱导培养8-24h，优选出最佳表达温度和时间分别是16℃和16小时。

(3)NosP的纯化制备：采用镍柱亲和层析的方法纯化制备纯度大于95％的NosP蛋白。