[发明专利]一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种PCR产物单体型分析方法，具体涉及一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法。

背景技术

人类基因组单体型图计划本身说明了单体型研究的重要性，也为个体样本的单体型分析提供了重要的数据库。位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的SNP的组合叫作单体型(haplotype)。早期的研究工作就表明，单体型的分析可以极大地减少疾病关联研究的工作量，且提供比SNP基因型分析更大的信息量，有利于发现更多的信息。理论上说，一个包含N个独立双等位基因的SNP区域中可能存在2n种单体型，但实际上，由于缺乏重组和(或)反复突变，SNP之间常常存在连锁不平衡的关系，因此，单体型的种类不会超过(N+1)。对于二倍体个体(如单个人)的DNA样本分析，一般情况下就是要从大样本所包含的可能单体型中找出具体属于哪一种或者二种单体型。如果两个相邻SNP位点间有一个SNP位点为纯合型，那么其单体型就很容易判断。因此，单体型分析就聚焦在两个相邻杂合型SNP间二种单体型的确定。目前对于单体型的分析，普遍采用间接方法是利用多个SNP分型结果，以统计方法推断，这种方法得到广泛的应用，且用于构建单体型的相关软件也非常之多。然而，软件分析的结果对于临床样本而言，如果得不到直接的实验证实终究是不踏实的，临床检测也很难接受这样的分析结果。通过实验方法得到自然状态下真实的单体型情况需要进行单分子测序(如克隆测序、高通量测序等)，这些方法由于成本高，不适于大规模的个体样本分析。对于常规PCR产物中包含多个SNP位点的实验分析单体型方法，均采用一种等位基因特异引物-PCR(AS-PCR)的方法，以第一个SNP位点为扩增起始点，用两种特异引物将起始为两种的不同DNA模板分别进行扩增，然后分别进行测序，以确定其它SNP位点的碱基信息。然而，这种方法既无法知道单体型的含量(需要另外设计实验来确定)，也不一定适合所有SNP位点的扩增，且操作繁琐、效率不高。我们知道利用测序引物在不同模板上发生不同步合成反应，焦测序技术不仅能够分型SNP位点，同时也能够对其模板含量进行定量分析。沿着这一思路，如果在一个包含N个SNP位点的PCR产物中，这种不同步合成测序继续对各个SNP位点的碱基信息进行读取，则除了在SNP位置提供不同DNA模板的信息外，其它位置由于SNP碱基的错位测序，也可以提供不同DNA模板的加和信息，并从这些加和信息中构建方程组实现对不同DNA模板的含量分析。

最近，我们实验室提出一种基于两核苷酸实时合成测序的方法，该方法通过每次反应同时加入未标记的两种dNTPs实时测序，得到两组编码，解码这两组编码便能确定测序片段的具体碱基信息(肖鹏峰等，中国发明专利：ZL 201210128597.6)。该方法具有大幅提高测序长度，且测序得到的测序信号强度比传单核苷酸合成测序的信号强等特点。然而，该发明专利对一个DNA模板样本需要两次测序既增加了操作的琐碎程度，也增加了分析的成本，且同步测序反应的信息不能满足对单体型的分析。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型的方法，为PCR产物单体型方法提供一种快速、高效、灵敏的分析方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，步骤包括：1)DNA提取；2)PCR扩增；3)测序；4)关联分析；

所述步骤3)的测序方法为：同时加入两个不同的核苷酸，PCR扩增产物中不同DNA模板的合成测序不同步，得到相邻两个SNP位点上不同的测序信息。

进一步的，在本发明中，所述步骤3)的具体方法包括以下步骤：

3-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与亲和素修饰的磁珠反应，修饰生物素的DNA链固定到所述磁珠上，在0.2M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA链清除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板；

3-2)测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板，在杂交反应体系中，80℃下放置5min，自然冷却至室温，完成杂交；

3-3)焦测序：配备焦测序反应体系，与所述步骤3-2)得到的杂交产物混合，按照循环加入两核苷酸方式对DNA模板进行循环焦测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息。