[发明专利]一种层层自组装的小口径组织工程血管及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术，具体是关于一种纳米颗粒修饰的层层自组装生物人工血管及其构建方法。

背景技术

近几年，心血管疾病的发病率以及死亡率逐年升高，每年有大量的病人需要进行旁路移植手术，因此临床上对于直径小于6mm的组织工程血管需求量很高。但是小口径组织工程血管常常由于血栓形成以及内膜增生而导致移植手术失败。大量的研究表明内皮细胞具有抗血栓、抑制血小板的聚集和平滑肌细胞病理性增殖的功能，因此组织工程血管的早期快速内皮化是维持小口径组织工程血管移植后通畅的一个十分重要的因素。内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，在缺血或者血管受损的情况下，可以从骨髓动员并归巢到相应部位，促进血管内皮的修复以及血管生成。因此，在组织工程血管的构建中选择合适的分子促进干细胞的动员，并能选择性的捕获血液中的内皮祖细胞是提高组织工程血管通畅率的一个重要研究靶点。

科学家通过在组织工程血管的内表面涂层抗体或者蛋白特异性捕获血液循环中的内皮祖细胞，在早期取得了较好的通畅效果。然而在移植后期出现了不同程度的内膜增生，甚至堵塞。究其原因，主要是因为组织工程血管内表面涂层的药物缓释时间较短，不能长时程的发挥功能。在移植后期药物释放完毕后，组织工程血管的局部微环境不适合归巢的内皮祖细胞的生存，但是可以刺激平滑肌的病理性增生。组织工程血管移植后都面临着高剪切力和高冲刷力的力学刺激，同时能快速的将物质推送到全身各个部位。因此对控释材料的安全性和稳定性具有特别高的要求。腺苷是一种内源性核苷，具有细胞保护和促进血管生成的作用。我们的研究发现腺苷可以促进内皮祖细胞动员归巢、促内皮祖细胞旁分泌和抑制平滑肌的病理性增殖等。然而目前还没有一种既安全又能稳定控制腺苷的释放，还能适合血液循环系统这个特殊环境应用的控释体系。

环糊精的研究经历了一百多年的时间，现已广泛的用于医药和生物技术等行业。β-环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，外侧由羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区，可以包裹各种化合物，具有很好的药物控释和生物可降解性等特点。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以通过氨基和羟基与腺苷或受体活化药物结合，目前也已经作为一种材料应用于药物制剂。研究表明β-环糊精和壳聚糖能够形成一个稳定的结合物，相对于单独的β-环糊精或者壳聚糖能更长时程的控制药物释放。

发明内容

本发明主要是针对现有技术的不足，提供一种能长时程控制药物释放，在早期在体动员和捕获内皮祖细胞的组织工程血管，促进血管快速内皮化，移植后期抑制内膜增生和血管狭窄，主要用于血管的取代治疗和冠状动脉搭桥。为实现本发明的上述目的而采用的技术方案，即构建一种能长时程控释又能促进早期快速内皮化的组织工程血管，其采用如下方法构建：

（1）控制药物释放的纳米缓释颗粒的制备：筛选具有内皮祖细胞动员捕获功能和微环境优化功能的药物，如腺苷及其A1，A2b,A2a,A3四个受体的激动剂等，筛选以及修饰合适的化合物，检测其对人体的安全性和不良反应。具体为：每80-100mg的β-环糊精与20-30mg的腺苷或腺苷A2a受体激动剂或腺苷A1受体激动剂或腺苷A2b受体激动剂或腺苷A3受体激动剂溶于20-30ml的去离子水中，获得溶液Ⅰ；每60-80mg的壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，获得溶液Ⅱ；按照溶液Ⅱ与溶液Ⅰ3-5：1的比例混合，离心分离，获得纳米缓释颗粒。

（2）组织工程血管基质的构建：用异种或同种血管或皮肤组织提取胶原，然后去除胶原中的抗原，获得生物相容性良好的胶原；保留胶原的天然网状结构。

（3）血管的编织：将所述胶原和弹性材料按重量百分比60～80％：20～40％用电纺丝纺织方法编织血管支架；或将所述胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料按重量百分比50～70％：12～18％：1～5％：15～35％用电纺丝纺织方法编织血管支架；或采用人工合成材料编织血管支架。

（4）层层自组装方式构建组织工程血管：将所述纳米缓释颗粒与所述血管支架孵育24-48小时，充分洗涤后，继续用纳米缓释颗粒孵育24-48小时，PBS洗三次；然后用腺苷或腺苷A2a受体激动剂直接孵育24小时，PBS洗三次；再用EDC或者SPDP交联24小时；获得层层自组装的工程血管。