[发明专利]浙江金线兰种苗的快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种繁殖浙江金线兰种苗的方法，属于植物组织培养快速繁殖技术领域。

背景技术

浙江金线兰Anoectochilus zhejiangensis Z.Wei&Y.B.Chang又称浙江开唇兰，是我国珍稀濒危的兰科植物之一，已列入国家二级保护植物名录，浙江省珍稀濒危植物名录。野生分布于浙江(遂昌)、福建(建阳、将乐)、广西(龙胜)等地，生于海拔700-1200米的山坡或沟谷的密林下阴湿处。为我国传统名贵草药，民间应用广泛。

浙江金线兰为兰科开唇兰属植物，种子微小胚发育未成熟，自然条件下种子发芽率低，其生长对环境条件要求高，自然繁殖和生长缓慢。随着人们的采挖、生态环境的破坏，野生浙江金线兰资源已非常稀少，濒临灭绝。

发明内容

本发明的目的在于提供一种浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，克服现有尚未建立其种苗快速繁殖的方法，以解决其种苗紧缺、资源濒危的问题，本发明所提供的方法不仅能有效提高浙江金线兰的繁殖效率，还能防止试管苗出现徒长和玻璃化现象，从而获得大量浙江金线兰种苗，为其规模化生产应用奠定基础。

本发明的技术方案如下：

浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：

(1)外植体的准备阶段

采集浙江金线兰植株，遮荫培养15-30天；从其中选择开始恢复生长的植株，剪取地上部份的茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为9-11％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒8-15分钟，无菌水冲洗干净，沥干水分备用；

(2)初代诱导培养阶段

在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为0.4-1.2cm，将所述茎段插入初代诱导培养基中进行初代诱导培养，培养周期为40-70天，培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为8-10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；

(3)继代培养阶段

将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为0.4-1.2cm，将所述茎段插入继代增殖培养基中进行至少一次继代培养，每次继代培养的培养周期为90-100天；

(4)生根培养阶段

将步骤(3)中每次继代培养获得的小苗，转移接种到生根培养基中培养，培养周期为90-120天；

(5)移栽种植阶段

将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗10-30天，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为120-180天；所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.0-2.5︰1的体积比例混合的混合物；

所述步骤(2)中的初代诱导培养基和步骤(3)中的继代增殖培养基均由以下组分按照以下配比组成：MS+0.1-0.5mg/L TDZ(噻苯隆)+0.5-0.8mg/L6-BA+0.18-0.25mg/L NAA+50-100g/L土豆泥+0.2-0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60；

所述步骤(4)中的生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+0.6-1.5mg/L NAA+50-100g/L香蕉泥+0.4-1.0mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60；

其中，6-BA是6-苄氨基嘌呤；NAA是a-萘乙酸；TDZ是噻苯隆；

MS培养基的基本组成如下表所述：

所述步骤(3)和步骤(4)中的培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10-12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％。

进一步的，

步骤(1)外植体的准备阶段中，所述的浙江金线兰植株为野生或栽培的浙江金线兰植株；所述遮荫培养指将采集得到的浙江金线兰植株种植于网室内干净的河沙中进行遮荫培养,所述网室的网目为20-40目，选取遮荫培养后的叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取其幼嫩茎节；用无菌水冲洗的次数为3-5次；每次冲洗的时间为1-2分钟；

步骤(2)初代诱导培养阶段和步骤(3)继代培养阶段中，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；所述茎段的形态学下端插入培养基中；所述继代培养的的次数为8-20次；