[发明专利]马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及病毒遗传操作领域，更具体地，本发明涉及一种马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用。

背景技术

马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。MDV经空气传播，传染力很强，被感染鸡产生肿瘤和死亡，造成巨大经济损失。马立克氏病是鸡的主要疾病之一，也是国内外50年代以来最受重视的鸡病。

MDV属于细胞结合性疱疹病毒，其基因组为线状双股DNA。MDV包括三种血清型，血清1型病毒具有致瘤性，可进一步分为几个病理型，包括温和型MDV(mMDV)、强毒型MDV(vMDV)、超强毒型MDV(vvMDV)及特超强毒型MDV(vv+MDV)病毒株。鸡的非致瘤病毒分离株和火鸡疱疹病毒分离株分别称作血清2型和3型MDV。当前现地用于MDV预防的疫苗主要是血清1型弱毒疫苗，814疫苗株是其代表毒株之一。814疫苗株基因组全长约174kb，该疫苗株自从上世纪80年代以来，安全使用30余年，无任何不良反应。814疫苗免疫效力高，可以对vv+MDV产生良好的免疫保护效果。而且该疫苗株是一个自然弱毒株，具有十分稳定的生物性状。因此，814疫苗株可以作为一个理想的载体，用于MDV活载体疫苗的研究。

常用的构建MDV重组病毒的方法主要有三种。一种是同源重组法，即将外源基因插入到入门质粒中转染病毒感染细胞或并与病毒基因组共转染易感细胞。该方法构建过程复杂费时而且效率较低，需要加入筛选标记基因并进行重组病毒的纯化。第二种是细菌人工染色体(BAC)法，它是将完整的MDV基因组插入到BAC中并在细菌中对其进行改造。BAC法是建立在同源重组基础上的，同样具有构建过程复杂、周期长的缺点。而且BAC自身序列难以去除，使得后期获得的重组病毒带有不必要的外源基因序列。第三种是粘粒法。粘粒是一种可以容纳30-45kb大小外源DNA的克隆载体，常用于基因文库的构建。该方法是将MDV基因组分段插入到粘粒中，然后共转染易感细胞拯救重组病毒，具有操作简便、构建周期短并易于进行改造的优点。其中Cosmid是一种传统的粘粒，它使用与质粒相同的复制子，其较高的拷贝数使其所建文库稳定性较低，且具有一定的偏向性。而Fosmid是最近几年才广泛用于基因文库构建的一种粘粒，具有稳定性好、无偏向性、拷贝数可诱导、构建周期短以及操作简便等诸多优点，其构建的基因文库保真性和稳定性均比Cosmid好，是目前用于替代Cosmid的新型粘粒(Vinayak,S.,Brooks,C.F.,Naumov,A.,Suvorova,E.S.,White,M.W.,Striepen,B.Genetic manipulation of the Toxoplasma gondii genome by fosmid recombineering.MBio.2014,5(6):e02021.)。应用Fosmid构建814疫苗株反向遗传操作系统并用其进行重组病毒的拯救，可以为MDV活载体疫苗的研究奠定坚实的基础，具有重要的应用前景。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统。

本发明的目的之二在于提供一种构建所述马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统的方法。

本发明的目的之三在于提供所述马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统在病毒拯救中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统，包含5个分别依次含有马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重组粘粒，其中所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GeneBank登录号为JF742597。

在本发明的一个具体实施例中，所述系统中的5个重组粘粒是通过将马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列插入pCC1Fos载体后得到的。