[发明专利]一种葡萄座腔菌的检测方法

权利要求书

1.一种三重荧光定量PCR的检测组合物，包括：

B.stevensii引物Bst-F:TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)

B.stevensii引物Bst-R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ ID No.2)

B.stevensii探针Bst-T：TGCGCTTATCTGCCGCCGTG(SEQ ID No.3)

B.obtusa引物Bob-F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)

B.obtusa引物Bob-R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ ID No.2)

B.obtusa探针Bob-T：ACAGCCCACCTTATCGCTCGGTGAG(SEQ ID No.4)

B.dothidea引物Bod-F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)

B.dothidea引物Bod-R：GGAGATTTTGCCGAAGACCA(SEQ ID No.5)

B.dothidea探针Bod-T：ACATTTTCTGTGCCTGCACGTGTGCTG(SEQ ID No.6)。

2.权利要求1的检测组合物，其中三条探针标记的荧光基团分别为FAM、NED、JOE，对应的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ1。

3.权利要求1或2所述的检测组合物，用于三重荧光定量PCR检测三种葡萄座腔菌的方法。

4.权利要求3的方法，包括以下步骤：

(1)采集待测样本；

(2)提取样本基因组DNA；

(3)用多重实时荧光PCR法检测；

其中，所述三种葡萄座腔菌选自B.stevensii，B.obtusa，B.dothidea。

5.权利要求4的方法，其中所述步骤(2)提取样本基因组DNA，是采用的是磁珠提取法。主要步骤如下：取研磨液放置于1.5mL离心管中；向离心管中加入600μL裂解液，涡旋震荡混匀15s，室温静置10min，12000rpm离心2min；取200μL上清于新的离心管中，加入200μL磁珠，震荡混匀，静置10min，收集磁珠，弃上清；加入500μL洗涤液，弃废液收集磁珠；加入500μL无水乙醇洗涤，弃废液收集磁珠；加入70％乙醇洗涤，弃废液收集磁珠；加入50TE buffer溶解，吸取上清液至新的EP管中，备用。

6.权利要求5的方法，其中所述步骤(3)用多重实时荧光PCR法检测，是指用以下引物和探针序列进行反应：鉴定B.stevensii引物为Bst-F和Bst-R，探针为Bst-T；鉴定B.obtusa引物为Bob-F和引物Bob-R，探针为Bob-T；B.dothidea引物为Bod-F和Bod-R，探针为Bod-T。

7.权利要求3-6的方法，其中所述实时荧光定量PCR反应体系总体积为25μL，三种真菌DNA模板同时扩增会产生干扰，对整个反应体系进行优化，最终多重实时荧光PCR法检测反应体系如下：

样本基因组DNA 2μL；

2xTaqman Express PCR Master Mix(Applied Biosystems,USA)，12.5μL；

B.stevensii探针Bst-T：0.25μL，浓度为10μmol/L；

B.obtusa探针Bob-T：0.25μL，浓度为10μmol/L；

B.dothidea探针Bod-T：0.25μL，浓度为10μmol/L；

B.stevensii引物Bst-F：1μL，浓度为10μmol/L；

B.stevensii引物Bst-R：0.5μL，浓度为10μmol/L；

B.dothidea引物Bod-R：0.5μL，浓度为10μmol/L；

RNase-free Water，7.75μL。