[发明专利]N‑2‑羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒的制备方法

权利要求书

1.N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的制备；

二、N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒的制备：

a、取1.2mg/mL N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖溶液5mL，向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min混合均匀，得溶液A；

b、将溶液A在室温、无菌条件下，以1200r/min磁力搅拌40min后，向其中匀速滴加1.2mg/mL N,O-羧甲基壳聚糖溶液2mL，得溶液B；

c、将溶液B于4℃、12000r/min离心20min，沉淀经去离子水洗三次，真空冷冻干燥24h，即得负载新城疫弱毒活疫苗的N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒；

步骤一中N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的制备方法为：

一、环氧丙基二甲基乙基氯化铵的合成

向10℃装有电动搅拌器、滴液漏斗和冷凝回流装置的干燥三口烧瓶中加入60mL环氧氯丙烷，不断搅拌并用滴液漏斗滴加22.12mL N,N-二甲基乙胺，1h内加完，同时加热至20℃，恒温反应8h后，停止反应，产品用冰丙酮洗涤，抽滤，尽可能除去产品中环氧氯丙烷等杂质,将抽滤后的产品置于表面皿中，放真空干燥器中干燥15h后备用；

二、N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的制备

a、壳聚糖的脱乙酰化处理

将11g脱乙酰度85％的壳聚糖分散在150mL质量分数为30％的NaOH溶液中，在100℃条件下回流搅拌反应5h，去掉上清液，沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处理的壳聚糖；

b、壳聚糖的浸泡处理

将5g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100mL体积浓度为2％乙酸溶液中，搅拌溶解5小时，逐渐滴入0.5mol/L的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH至9，当有白色沉淀析出时浸泡12h，抽滤，再用去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，烘干后得到浸泡处理后的壳聚糖；

c、壳聚糖与环氧丙基二甲基二乙基氯化铵的开环反应

将上述浸泡处理后的壳聚糖倒入三口烧瓶中，加入35mL异丙醇，搅拌分散均匀后呈浆状，将三口烧瓶升温至60℃，滴加50mL环氧丙基二甲基二乙基氯化铵的异丙醇溶液，30min内滴完，反应11h，反应结束后，壳聚糖已经与环氧丙基二甲基二乙基氯化铵完全反 应得到N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖，所以全部溶解在溶液中，溶液变澄清，烧杯底部有浅黄色粘稠物，冷却至室温，静置，分层，加入冷藏处理的无水乙醇200～400mL沉淀，粘稠物颜色变浅，浸泡0.5h后抽滤，于50℃真空干燥，得到粗制的N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖；其中50mL环氧丙基二甲基二乙基氯化铵的异丙醇溶液中含9g环氧丙基二甲基二乙基氯化铵，环氧丙基二甲基二乙基氯化铵的异丙醇溶液中的环氧丙基二甲基二乙基氯化铵与壳聚糖的质量为5∶1；

d、N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的精制

将粗制的N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，3G纱芯漏斗过滤，滤液在5倍体积丙酮中沉淀得到淡黄色沉淀物，即为N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖；

步骤二b中N,O-羧甲基壳聚糖溶液的制备方法为：

一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1～12h后加入60mL浓度为10～40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖；

二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，在搅拌状态下分5次加入到碱化壳聚糖中，每次间隔10min，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1％的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95％的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N,O-羧甲基壳聚糖的合成。