[发明专利]一种贝类总病毒核酸的制备方法在审
| 申请号： | 201510201269.0 | 申请日： | 2015-04-23 |
| 公开（公告）号： | CN104946624A | 公开（公告）日： | 2015-09-30 |
| 发明（设计）人： | 姜敬哲;黄晟;何健;王江勇 | 申请（专利权）人： | 中国水产科学研究院南海水产研究所 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93 |
| 代理公司： | 广州知友专利商标代理有限公司 44104 | 代理人： | 宣国华;马赟斋 |
| 地址： | 510300 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 贝类 病毒 核酸 制备 方法 | ||
1.一种贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)磨粉：在液氮环境下，将贝类组织样品磨成粉；
(2)匀浆：贝类组织样品粉末中加入PBS缓冲液，然后匀浆成浆料；
(3)获得总病毒粗提物：浆料经离心处理，所得的上清液经滤膜过滤后离心处理，弃上清液，所得的沉淀即为总病毒粗提物；
(4)提取核酸：所述总病毒粗提物加入核酸酶溶液，制成悬浮液，于37℃摇床处理25-40min，而后提取总病毒核酸；
(5)核酸扩增：对所述总病毒核酸进行扩增，以提高核酸浓度，有利于高通量测序。
2.根据权利要求1所述的贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PBS缓冲液与贝类组织样品之间的体积质量比为10-12﹕1。
3.根据权利要求1或2所述的贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PBS缓冲液含有以下组分：NaCl 135-140mmol/L，KCl2.5-3.0mmol/L，Na2HPO48-12mmol/L，KH2PO41-2.5mmol/L，pH7.5。
4.根据权利要求3所述的贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，过滤前的离心处理至少进行两次，离心条件为：4℃，10000-12000rpm离心25-35min。
5.根据权利要求4所述的贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，滤膜采用Millex-HV 0.45um滤膜。
6.根据权利要求5所述的贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，所述过滤后的离心处理的条件为：10℃，35000-45000g离心1-1.5h。
7.根据权利要求6所述的贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，核酸酶溶液含有以下组分：100U DNase I，100ug RNase A，10-12mM Tris-HCl，2.0-3.0mM MgCl2，0.5-1mM CaCl2，pH7.5。
8.根据权利要求7所述的贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用HP Viral DNA/RNA Kit进行核酸提取。
9.根据权利要求8所述的贝类总病毒核酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，采用illustra GenomiPhi HY DNA Amplification Kit进行核酸扩增。
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