[发明专利]一种创伤弧菌快速检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种创伤弧菌快速检测试剂盒。

背景技术：

创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)是一种广泛分布于亚热带浅海水域及海产品如贝类、虾、蟹等，气候温暖的六月至十月，海中此类淡菌浓度高。创伤弧菌是革兰氏阴性菌，具移动性、弯曲的杆菌，单独存在或尾端连扬戊C”或者“S型。对酸吐敏感，pH6以下就不生长。目前已发现100多种，其中至少4种会致病。创伤弧菌的感染造成临床上的病症有两种：1、原发吐败血症(primary septicemia)此由肠胃感染引起的，是由于吃入生的或未煮熟的鱼虾类或生蚝，病人会有发热、恶心、呕吐、皮肤病变、坏死胜溃烂及败曲一症休克等症状。创伤弧菌可放出强烈毒素进入血液，将引起败血病及体克，诱发全身器官衰竭导致死亡，死亡率高达50%以上，如果因而休克，死亡率更是在百分之九十以上；2、伤口感染(infected wound)慢性肝炎患者或者免疫力弱的人，若皮肤有伤口又接触到含有病菌的海水或被虾、蟹类刺伤，就有可能被创伤弧菌感染。感染该菌种的初期，在感染部位有肿胀、红斑、进而形成水泡，之后伤口溃烂蔓延，创伤弧菌会入侵筋膜和肌肉的间隙，出现组织坏死或严重的蜂窝性组织炎，然后病菌沿着间隙直上继续感染。创伤弧菌感染病情发展快速，通常脚趾头蔓延到大腿只需一到两天时间。有时候甚至需要截肢来阻止感染蔓延，如果不幸很可能引发次发性败血症造成死亡，死亡率约为24%。

在LAMP反应中，不需要通过热变性将双链DNA变成单链， 因为双链DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任伺一条引物与双链DNA的互补链部位进行碱基互补配对延伸时，另一条链就会脱落成为单链。

LAMP的原理：环介导等温扩增技术是2000年由日本Notomi T等人研发的核酸扩增方法，其原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase )，在恒温条件(65℃左右)保温约1h，即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带，并可通过设计两条环引物使反应速度提升1/2~1/3。在DNA延伸合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，产生焦磷酸镁衍生物，呈现白色沉淀，只需肉眼观察即能判断扩增与否；亦可用结合双链DNA的荧光染料SYBR GreenI染色，在紫外灯或日光照射透视下呈现强荧光。如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。

LAMP的优点：环介导等温扩增技术具有以下优点：(1)特异性强：4条引物(或6条引物)对靶序列的6个特异序列区的识别，受非靶序列的影响小，保证了LAMP扩增的高度特异性；(2)敏感性高：检测限更低，仅为6个拷贝，高于PCR法；(3)快速：在1h内可将靶序列扩增至10^--9~10¹⁰倍，产率可达到0.5 m g/mL 。向反应体系中添加2条环引物(Loop Primers )，可进一步提高LAMP反应的速度，缩短反应时间：(4)操作简便：不需PCR仪和特殊试剂，只需一恒定温度，即能扩增目标基因，模板也不需要热变性。扩增产物不需繁琐的电泳，肉眼即可判断。加入逆转录酶，还可进行RT LAMP，完成针对RNA病毒的扩增；(5)实时定量：可克服常规PCR只能定性检测的不足。可见，LAMP有利于在一些基层机构的应用和大规模样品的检测，为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持，在食品卫生质量检验、临床疾病诊断及微阵列基因芯片的开发等领域具有广阔的应用前景。

因海洋创伤弧菌的危害性和快速发病的特点，需要快速进行检测。为了加快反应的速度，将常规的LAMP法检测创伤弧菌进行优化，选择了适宜的引物，通过两种表面活性剂的作用，增加反应组分的有效接触面积，加快反应的进行。试剂组分中加入与聚合酶等量的水解酶（UNG酶），可以有效将扩增反应时间控制在30分钟，比常规检测检测方法用时（50分钟）要短，加快了临床的检测时间，增强了LAMP法检测创伤弧菌的应用性。

发明内容

针对创伤弧菌检测试剂盒（LAMP法）检测时间较长的问题，本发明提供了一种创伤弧菌快速检测试剂盒（LAMP法）。本发明优化了组分，通过调整表面活性剂和加入UNG酶的作用，加快了检测的时间，增强了试剂的临床检测应用。

本试剂盒包括以下组分及含量的试剂：

（1）10×反应缓冲液                      2.5μL