[发明专利]净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱及其制备方法与应用在审
申请号: | 201510201533.0 | 申请日: | 2015-04-24 |
公开(公告)号: | CN104784973A | 公开(公告)日: | 2015-07-22 |
发明(设计)人: | 王国民;陈冬东;王伟;唐柏彬;马吉湘;李贤良;果旗;里南;董韬;王雄;周超;郗存显 | 申请(专利权)人: | 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心;中国检验检疫科学研究院;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心;北京中检维康生物技术有限公司 |
主分类号: | B01D15/38 | 分类号: | B01D15/38;B01J20/281;G01N1/34;G01N1/40 |
代理公司: | 重庆市恒信知识产权代理有限公司 50102 | 代理人: | 刘小红 |
地址: | 400020*** | 国省代码: | 重庆;85 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 净化 多巴胺 复合 免疫 亲和 及其 制备 方法 应用 | ||
1.净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱,其特征在于,制备方法如下:
a)基质制备
称取1g琼脂糖凝胶基质粉末,溶于1mmol/L HCl中,然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mmol/L HCl洗涤15min;
b)配体偶联
使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO3pH8.3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体和抗莱克多巴胺单克隆抗体,获得抗体溶液,迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中,充分混匀上述的混和物2-4h;
c)配体封闭
封闭所有残留的活性基团,转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中,室温条件下静置2-4h;
d)除去偶联后未偶联上的多余的配体
依次用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c)处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤,至少洗涤3个循环;
e)装柱
用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01%NaN3-PBS洗涤,并使用0.01%NaN3-PBS保存,然后装柱。
2.根据权利要求1所述净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱,其特征在于:所述抗苯巴比妥单克隆抗体采用常规单克隆抗体制备方法制备。
3.根据权利要求1所述净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱,其特征在于:所述制备抗苯巴比妥单克隆抗体的抗苯巴比妥单克隆抗体细胞为细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.9203。
4.一种净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱的制备方法,其特征在于,包括:
a)基质制备
称取1g琼脂糖凝胶基质粉末,溶于1mmol/L HCl中,然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mmol/L HCl洗涤15min;
b)配体偶联
使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO3pH8.3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体和抗莱克多巴胺单克隆抗体,获得抗体溶液,迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中,充分混匀上述的混和物2-4h;
c)配体封闭
封闭所有残留的活性基团,转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中,室温条件下静置2-4h;
d)除去偶联后未偶联上的多余的配体
依次用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c)处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤,至少洗涤3个循环;
e)装柱
用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01%NaN3-PBS洗涤,并使用0.01%NaN3-PBS保存,然后装柱。
5.利用权利要求1所述复合免疫亲和柱,进行苯巴比妥和莱克多巴胺检测的方法,其特征在于:包括如下步骤:
用所述复合免疫亲和柱净化待测样液,然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱,流速为1mL/min~2mL/min,收集全部洗脱液于玻璃试管中,供HPLC分析;
高效液相色谱条件
苯巴比妥
色谱柱:Cloversil-C18,4.6×250mm
流动相:甲醇:水=50:50(v/v)
流速:0.8mL/min
检测器:紫外检测器,波长254nm
进样体积:50~100uL;
莱克多巴胺:
色谱柱:Cloversil-C18,4.6×250mm
流动相:乙腈:0.05%三氟乙酸=20:80(v/v)
流速:0.8mL/min
检测器:紫外检测器,波长224nm
进样体积:50~100uL;
定量
用进样器吸取50μL标准工作液注入高效液相色谱仪,在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值,分别得到标准溶液高效液相色谱图。
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