[发明专利]一种结核分枝杆菌ESAT‑6蛋白检测试剂盒、制备方法以及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种结核分枝杆菌ESAT-6蛋白检测试剂盒、制备方法以及使用方法。

技术背景

本发明建立了一种检测结核分枝杆菌相关抗原ESAT-6的纳米磁珠-近红外荧光标记-检测试剂盒。包括单克隆抗体的近红外荧光染料标记方法和纳米磁珠的多克隆抗体包被方法以及系列相关试剂。本发明以近红外荧光染料作为标记，采用免疫分析原理，制备检测ESAT-6双抗体夹心法近红外荧光试剂盒。采用便携式流动进样荧光检测器进行磁珠-结合物荧光强度测定。定量检测时，将样本检测值代入标准方程，即可分析检测样本中靶蛋白的浓度；定性检测则以阴性对照的荧光强度的2倍作为反应体系的cutoff值，大于2倍cutoff值为阳性，反之则为阴性。该试剂盒适用于病理样本中结核分枝杆菌相关蛋白的检测。本发明具有快速、高敏、兼顾定性及精准定量的特点。

结核病是一种古老的传染性疾病，目前全世界有1/3的人口受结核分枝杆菌的感染，每年有近800万人死于肺结核；耐药性和多重耐药性菌株的大量出现，又为结核病的控制带来更大的困难；更多的研究还证实结核分枝杆菌能增强HIV-1病毒的复制，因此在艾滋病感染者中，双重感染者众多，成为导致AIDS患者死亡的主要原因。我国目前的TB患者数量居世界第二位,是世界上22个TB高负担国家之一，2000年我国第4次TB流行病学抽样调查资料显示,我国MTB感染率为44.5％,活动性TB患者451万,每年死亡人数达13万。

目前对于结核分枝杆菌的检验手段主要有涂片镜检法，该方法需要检测人员具有熟练的检验技能，方法检测灵敏度低，一般需标本中存在1*10³CFU/ml个细菌才有10～15％的阳性率,并且对细菌无法进行准确的鉴定；培养法，主要在传染病医院进行该项工作，检测周期较长，一般需要6周时间才能发报告，晚近出现的全自动微生物鉴定仪虽然大大缩短了检验周期，通常需要2周左右时间，这仍未根本解决效率的问题，并且存在着成本高昂的缺陷，单纯的试剂成本在120元/测试，且需要大型的设备；血清学检验方法主要集中在对结核分枝杆菌相关抗体的检测，由于结核感染患者存在免疫力低下的问题，往往不表达相关抗体，或者由于成人感染结核菌几率多，由于免疫记忆，许多曾感染者也可检测出相关抗体，这就为判断造成麻烦；分子生物学的手段近来广范运用于临床检测，诸如PCR法、探针检测法等，这些方法特异性好，但需要特殊的检测仪器，推广运用存在问题，超高的灵敏度也带来了难以克服的问题-假阳性；结核感染T细胞斑点试验用于检测结核感染后特异性T细胞分泌的γ-干扰素，并据此结果判断是否感染了结核，该方法特点是繁琐，成本高，不宜推广，目前主要在西方国家作筛查使用；结核分枝杆菌特异性噬菌体扩增试验也曾在结核病实验室发挥过作用，也存在繁琐、成本高，在结果判断中需要足够的经验的缺点。该方法的假阳性率为3％～7％,假阴性率为15％～40％。与培养的阳性符合率为75％～95％,特异性为88％～99％。

本发明将纳米磁珠法与近红外荧光标记法结合起来，利用纳米磁珠表面羧基活化后可与抗体表面的氨基共价结合，从而将抗体固定到纳米磁珠表面，发挥了纳米磁珠比表面积大，吸附性强，悬浮稳定性好，有利于抗原抗体反应顺利进行的特点；同时近红外荧光染料具有灵敏度高、选择性好的优点，它的激发光以及发射光光谱均在近红外区域，可最大限度减少环境中杂散荧光物质的干扰等优点。建立起结核分枝杆菌相关抗原ESAT-6的近红外荧光标记-纳米磁珠检测方法，ESAT-6检测限量达0.5ng/ml水平。

试剂盒组成  20人份

1、A液近红外荧光染料标记ESA-6单克隆抗体  1ml

2、B液ESAT-6多克隆抗体包被磁珠           1ml

3、PBS缓冲液                             10ml

4、ESAT-6标准品(1000ng/ml)               0.2ml

发明内容

为了克服上述缺陷，提供以下技术方案：

一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT-6蛋白检测试剂盒，所述试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为鼠抗ESAT-6；包被纳米磁珠的多克隆抗体为鼠多抗ESAT-6。建立ESAT-6蛋白标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标蛋白含量的定量(定性)检测。