[发明专利]一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法

权利要求书

1.一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取梨种苗基因组DNA；

(2)以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列为引物，步骤(1)得到的梨种苗基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)检测步骤(2)得到的扩增产物；

(4)分析凝胶电泳结果，若凝胶电泳中同时出现大小为60bp和90bp的条带，则判定该种苗为‘苏翠1号’杂交种苗。

2.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，梨种苗基因组DNA的提取方法如下：

(1a)取梨幼嫩叶片约0.1g，用液氮研磨，加入500μl CTAB裂解液与0.2％v/v的β-巯基乙醇，将得到的混合物在65℃下放置30～50min，

所述的CTAB裂解液的组成如下：0.2g/L CTAB，2mol/L NaCl，20m mol/L EDTA，100m mol/L Tris-HCl，pH＝8.0；

(2a)取出混合物室温下12,000rpm离心10min，上清液转入新灭菌的1.5ml的离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇混合液，混匀，室温12,000rmp条件下离心10min；

(3a)将上清液吸入新的离心管中，重复步骤(2a)1次，向上清液中加入体积为上清液的0.1倍的醋酸钠和与上清液等体积的预冷的异丙醇并缓慢上下翻转，放于-20℃冰箱30min以上；

(4a)4℃，12,000rmp条件下离心10min，倒掉上清液，用体积分数为70％预冷的乙醇洗涤沉淀物；

(5a)4℃，12,000rmp条件下离心2～4min，倒掉上清液，得到的沉淀物即为梨种苗基因组DNA，将沉淀物干燥后加入80μL灭菌的TE缓冲液溶解梨种苗基因组DNA，保存于4℃或-20℃备用。

3.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的PCR扩增，其反应体系为20μL，其中，梨种苗基因组DNA 10ng，Mg²⁺2.5mmol·L^-1，dNTPs 0.15mmol·L^-1，SEQ ID NO：1～2所示的引物各0.5μmol·L^-1，TaqDNA聚合酶0.75U。

4.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的PCR扩增，其PCR扩增程序为：90℃3min；94℃1min，35℃1min，72℃1.5min，5个循环；94℃1min，50℃1min，72℃1.5min，33个循环；72℃7min延伸，10℃保存。