[发明专利]一种利用耐热β-葡萄糖苷酶及其突变体进行虎杖苷生物转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说涉及一种耐热β-葡萄糖苷酶突变体N223T、G224F和N223T/G224F，以及该酶及其突变体在虎杖苷转化为白藜芦醇中的应用。

技术背景

白藜芦醇是一种活性多酚类物质具有抗氧化、抗自由基作用,对造成动脉粥祥硬化和血栓形成的各种氧化反应起抑制作用，白藜芦醇已被列为抗心血管抗癌最有前途的药物之一。白藜芦醇多存在于藜芦、虎杖和葡萄皮中，通常其含量较低，如干燥虎杖根茎中白藜芦醇含量仅为0.1％-0.2％，而虎杖苷的含量明显高于白藜芦醇，约为2％左右。研究发现，糖苷形式的虎杖苷和牛蒡子苷不具有最佳的生理活性状态，须在β-葡萄糖苷酶的作用下转化成甙元形式的白藜芦醇和牛蒡子苷元才能被吸收而发挥药效。因此，若将虎杖苷转化成白藜芦醇，会大大提高白藜芦醇生产得率,提高其生物利用率，降低成本。目前制备白藜芦醇的方法主要有：酸、碱水解方法和酶水解法。由于酸碱的应用存在对甙元破坏性大，污染大，目的性差等缺点，因此，酶水解法以其具有高效、安全、生态和环保等特点是大白藜芦醇和牛蒡子苷元制备的理想途径。陈雪香等人公开一种白藜芦醇生物转化菌进行白藜芦醇生物转化的方法(CN201210188784)；向极钎等人公开一种从虎杖中酶法制备高纯度白藜芦醇的方法(CN201210432150)；李志平等人公开了一种高纯度白藜芦醇的制备方法即将原料药材虎杖粉碎经乙醇抽屉后添加复合酶制剂进行酶解获得高纯度白藜芦醇(CN201310725682)；黄黎锋人公开一种新的水解虎杖苷制备白藜芦醇的β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及其应用(CN201210017857)；林元山等人公开一种利用微生物菌株棘孢曲霉(Aspergillus.aculeatusCGMCCNo.3876)及其发酵制备的复合酶进行生物转化白藜芦醇苷为白藜芦醇的方法(CN200910234069)。尽管相关专利申请较多，但是仍未能很好解决转化时间长，酶作用底物特异性不高，收率低以及成本高的问题。

酶的热稳定性直接关系到酶的使用寿命，从而决定酶的应用效率和酶的价值。极端嗜热袍菌属Thermotoga所产的β-葡萄糖苷酶(Tm-BglA)属于水解酶家族1，在95℃下保温6h仍保留60％活性，具有极高的耐热性，其在生物转化中具有减少污染危险、加快反应速度、提高酶作用底物溶解度和较高的抗化学变性等优点，同时可实现高底物浓度的热水抽提与酶水解并存的生物转化工艺，极具工业应用潜力。但是野生型Tm-BglA水解作用的底物范围广，包括纤维二糖、乳糖、水杨苷、熊果苷、烷基糖苷、对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷和对硝基苯酚-β-D-果糖苷、对硝基苯酚-β-D-半糖乳糖苷、黄豆苷、染料木苷、丙二酰黄豆苷、丙二酰染料木苷、昆布二糖和槐糖，若能提高Tm-BglA对虎杖苷转化为白藜芦醇的底物特异性，将会大大提高虎杖苷和牛蒡苷的转化效率，降低反应副产物，进而提高白藜芦醇的产量与纯度，降低生产成本。

科学研究表明：游离形式的白藜芦醇水溶性最差，基本不溶于水，而葡萄糖苷型的虎杖苷易溶于热水，在60-95℃时其溶解度随着温度的升高而显著增加，因此。本发明针对此特性，将耐热β-葡萄糖苷酶用于虎杖苷原料的热抽提取工艺中，进行边抽提边转化，使得虎杖苷一旦从固相原料中溶出即被去糖基进而转化为白藜芦醇，这样用80％乙醇直接提取离心所得沉淀即可得到白藜芦醇。因耐高温β-葡萄糖苷酶稳定性高，所得残液中酶残余活性和有效成分可回用。

发明内容

本发明通过对极端嗜热袍菌属(Thermotiga)的家族1的β-葡萄糖苷酶Tm-BglA与纤维四糖进行分子对接，以及Tm-BglA的苷元结合位点预测，选择位于Tm-BglA蛋白结构中第五β-折叠股上的两个氨基酸(N223和G224)进行单突变和双突变，分别将位于223位和224位上的天冬酰胺(N)和甘氨酸(G)分别替换成苏氨酸(T)和苯丙氨酸(F)，获得突变基因，然后插入表达质粒并转化宿主获得重组工程菌，令其表达，获得β-葡萄糖苷酶突变体N223T、G224F和N223T/G224F，进一步将这些耐热β-葡萄糖苷酶及其突变体水解虎杖苷后，酶解产物经高效液相色谱检测分析发现：水解10-20min后突变酶N223T和G224F对虎杖苷转化为白藜芦醇的效率分别提高了41.65％和25.87％；β-葡萄糖苷酶及其突变体N223T和G224F转化虎杖苷为白藜芦醇单位每小时转化率分别达到92.1％、96.2％、93.7％。