[发明专利]基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的PCR促进剂制备与应用技术，尤其涉及一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂制备与应用技术，属于基因工程技术领域。

背景技术

PCR技术的出现使得体外快速制备特定DNA分子成为可能，目前广泛应用于各种核酸扩增与检测领域，极大地促进了核酸诊断技术、现代基因工程、重组蛋白质工程的发展。由于PCR的扩增产量、DNA有效扩增长度等受多种因素的影响，目前开发了多种改善PCR性能的技术。这些技术主要包括优化PCR反应体系组分，例如通过加入二甲基亚砜(DMSO)、优化镁离子浓度等。目前这些技术能够在一定程度上改善PCR性能，但也存在通用性、重复性差等问题，特别是更换目的基因片段后，通常需要重新优化这些PCR反应条件。

作为PCR技术的核心试剂，DNA聚合酶性能的改良是PCR的核心。由于基于热循环的PCR，高温会使PCR反应底物之一脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)水解脱氨，生成脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)，脱氧尿嘧啶核苷三磷酸会被DNA聚合酶掺入合成的DNA分子中，掺入DNA中的尿嘧啶碱基严重抑制DNA聚合酶活性，最终降低DNA有效扩增长度和扩增产量。另一方面，插入DNA的脱氧尿嘧啶碱基还会与鸟嘌呤配对，导致颠换型碱基突变。然而传统型PCR改良剂对这些问题无能为力。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶(dUTPase)的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用；本发明中的蛋白型PCR促进剂具有通用性广、综合性能优良等特点。该蛋白型PCR促进剂不仅能显著提高多种商品化DNA聚合酶的PCR产量，还可以增加PCR扩增片段有效扩增长度。

本发明蛋白型PCR促进剂的作用原理主要在于：脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶能将脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解成脱氧尿嘧啶核苷酸，阻止尿嘧啶核苷酸掺入合成的DNA分子中，从而消除DNA中尿嘧啶对DNA聚合酶的抑制作用，提高PCR产量和DNA有效扩增长度。

本发明的技术方案具体如下。

本发明提供一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的重组表达质粒

基于嗜热微生物基因组信息，设计其编码的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，在此基础上，修改优化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶编码基因的稀有密码子，采用全基因合成技术合成嗜热菌株的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒；

(2)重组表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶

将构建的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶诱导表达；

(3)亲和纯化表达的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶

离心收集诱导表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶；

(4)检测脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的酶活性和热稳定性，筛选出蛋白型PCR促进剂

将纯化后脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP、dGTP；同时其95度下酶活性半衰期不低于30分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。

本发明中，步骤(1)中，所述嗜热微生物包括火球菌(Pyrococcus furiosus)、詹氏产甲烷古菌(Methanococcus jannaschii)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)等嗜热微生物。

本发明中，步骤(2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将耐热型脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株培养至OD₆₀₀＝0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。