[发明专利]一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

 本发明属于组织工程的生物材料技术领域。更具体地，涉及一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用。

背景技术

组织工程和再生医学技术是一种新兴的组织器官再生与修复手段，是建立在化学、材料学、生命科学和工程学等基础上的交叉学科，经过二十余年快速发展，已继外科重建和器官移植后，第三种组织和器官缺损或功能衰竭的治疗手段。组织工程的三个关键因素分别是种子细胞的培养，组织支架的制备以及细胞支架复合体的形成，其中核心是细胞和生物材料所构成的细胞支架复合体。细胞微载体是近二十多年发展起来并得到广泛应用的细胞复合支架，既不改变细胞附着表面生长成单层的特性，又大大提高了培养表面积和容积之比，使细胞得到较大规模的培养。生物降解细胞微载体不仅可以作为细胞的高密度培养微载体，也可以作为组织工程中的可注射型细胞载体用于对组织和器官缺损的修复和再生。

但是，以往研究的生物降解微载体均是微球状载体，在成骨细胞/微载体/水凝胶复合体系体内注射的实验当中表明，该体系输送细胞的效率相对不高，细胞仅能依附于载体表面单层生长，而复合体系中大多数空间被无细胞的载体或水凝胶所占据，不利于大量地高密度输送治疗细胞，为新生组织预留的空间也不足。虽然利用多孔的微球代替实心微球，可以部分解决这一问题，但由于这种材料要满足注射治疗的需要，因此需要这种多孔微球的内部网孔结构非常小，而这么小的网孔使得细胞很难进入微载体球体中心部位。

因此，需要设计制备新型结构的细胞微载体，满足可注射组织修复的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有生物降解微载体的缺陷和技术不足，提供一种即可满足可注射组织修复的需要，又具有很高的细胞输送效率，而且具有很好的生物相容性和生物可降解性的中空开放明胶细胞微载体。

本发明另一目的是提供上述中空开放明胶细胞微载体的制备方法。

本发明再一目的是提供上述中空开放明胶细胞微载体的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种中空开放明胶细胞微载体的制备方法，首先以明胶和蜂蜡为原料，使用双乳法制备明胶蜂蜡微球，再在乙醇/水溶液中重塑，然后在戊二醛/乙醇溶液中交联，最后挤出明胶微球内部的蜂蜡小球，得到中空开放明胶细胞微载体。

具体地，上述制备方法包括如下步骤：

S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球

S11.明胶水溶液加热至70～80℃，加入蜂蜡，搅拌5～10min，得到蜂蜡/明胶乳液；

S12.将蜂蜡/明胶乳液倒入60℃预热好的食用油中，搅拌、乳化10～15min；然后倒入-20～4℃预冷的冰乙醇中，静置；

S13.二氧六环/丙酮溶液反复清洗（除去食用油），干燥，得到明胶蜂蜡微球；

S2.把明胶蜂蜡微球依次放进乙醇溶液、戊二醛溶液中进行重塑和交联；

S3.最后对明胶蜂蜡微球进行挤压，去掉球内的蜂蜡，即得中空开放明胶细胞微载体。

更具体地，上述制备方法的步骤如下：

S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球

S11.配制1%（w/v）明胶水溶液，加热至70～80℃，在400～700rpm的搅拌下，加入蜂蜡，搅拌3～15分钟；明胶与蜂蜡的用量比为1：1～5；

S12.将S11所得乳液倒入60℃预热的食用油中，在200～600转/分的转速下乳化5～30分钟；

S13.将S12所得混合液倒入-20℃预冷的冰乙醇中，静置15～30分钟；

S14.用二氧六环/丙酮溶液反复清洗，干燥，得到明胶蜂蜡微球（明胶蜂蜡微球的直径为200～400μm，适用于制备大小合适的微载体）；

S2.重塑：将S1所得明胶蜂蜡微球置于70～85%乙醇/水溶液中，70℃重塑3～8分钟，干燥得到重塑后的明胶蜂蜡微球；

S3.戊二醛交联：将重塑后的明胶蜂蜡微球放置在戊二醛/乙醇溶液中，4℃交联10～24h，乙醇反复清洗，真空干燥得到交联后明胶蜂蜡微球；

S4.挤压去蜡：用力挤压交联后明胶蜂蜡微球，所有微球均被挤破后，浸泡在正己烷溶液中，过夜，乙醇清洗多次，干燥即得中空开放明胶微载体。

其中，优选地，步骤S2的具体操作如下：

S21.取明胶蜂蜡微球置于细胞培养板（如24孔板）中，细胞培养板在桌面上轻轻敲打，使微球颗粒紧密堆积，表面平整；

S22.用注射器将85%的乙醇溶液注射入微球中，明胶蜂蜡微球和乙醇的用量比为1g/mL；