[发明专利]一种软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法

说明书

本发明涉及一种软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)软鳍新光唇鱼肌肉的获取：高锰酸钾和酒精联合对鱼体进行消毒；2)原代培养：采用含有硫酸卡那霉素、硫酸链霉素以及两性霉素B的DMEM培养液进行培养；3)传代培养：传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，所述软鳍新光唇鱼肌肉细胞系建立成功。本发明的构建方法所获得的软鳍新光唇鱼肌肉细胞系形态为不规则多角形，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对软鳍新光唇鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要。

技术领域

本发明涉及一种利用软鳍新光唇鱼肌肉组织建立细胞系的方法，属于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存的技术领域。

背景技术

软鳍新光唇鱼Neolissochilus benasi((Pellegrin&Chevey,1936))，旧称软鳍四须鲃，隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲃亚科(Barbinae)新光唇鱼属(Neolissochilus)，主要分布于红河水系。随着中国境内红河水系水电的开发，对河道内多种珍稀土著鱼类产生了诸多不利的影响，因此，2007年由云南省环保局批准立项，云南大唐国际李仙江流域水电开发有限公司委托中国科学院昆明动物研究所开展了软鳍新光唇鱼的人工增殖放流研究，最终于2010年突破了软鳍新光唇鱼的人工繁殖技术，并于2012年将软鳍新光唇鱼鱼苗放流回李仙江流域，基本完成了这一珍稀土著鱼类人工增殖放流的全过程。

软鳍新光唇鱼野外生存环境的不断恶劣，尽管已实现了软鳍新光唇鱼的人工增殖放流，但野外种群数量仍在锐减，因此，除加强野外引种，使更多的野外种群在保育研究基地得以存活外，软鳍新光唇鱼野外种群的种质资源保存已刻不容缓。在种质资源保存方法中，细胞培养和冻存应用较为广泛，已在其他动物或海水鱼类的种质资源保存过程中得到广泛认可，但此技术在淡水鱼类尤其是云南土著珍稀鱼类种质资源保存中的应用较少，软鳍新光唇鱼的细胞培养方面的研究亦是一片空白。

尽管软鳍新光唇鱼人工繁殖技术已研发成功，并有计划的放流回李仙江流域，但由于养殖鱼类本身的局限性，塘养环境下人工繁殖易造成染色体异常，如多倍化和异倍化，需要细胞短期培养以用于核型分析以检测人工繁殖品种的质量，保证放流个体的成活率和繁殖率。而对于软鳍新光唇鱼这种幼体生长较慢，个体相对较小，血液量较少的鱼类而言，传统的血液短期培养不能满足核型分析的需要，因此有必要寻找能快速获得细胞的方法，以满足软鳍新光唇鱼细胞的短期培养用于核型分析。

鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今已建立了280余株细胞系，中国的鱼类细胞培养历经30多年，只建立了50余株细胞系，建立细胞系的物种不足中国鱼类总数的1.5％(中国鱼类超过3500种)，由此可见，细胞系的构建速度是非常缓慢的，关注度不够、参与的工作者较少可能是其原因之一，另外，相较于哺乳动物细胞培养，鱼类细胞培养中更易发生污染，导致失败率上升，而现有的专利或文章中大多将这一现象归结为技术不过关，而嫌少注重鱼体本身的质量问题，在软鳍新光唇鱼细胞培养实践中，鱼体的生活状态也直接影响了细胞系构建的成败，因此，软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的成功构建是建立在对软鳍新光唇鱼野生和塘养生态习性极度了解的基础上的。经文献检索，未见与本发明的相同报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便易行的软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法，以满足对软鳍新光唇鱼快速核型分析、种质资源保存和理论研究的需要。

本发明提供了一种软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

1)软鳍新光唇鱼肌肉的获取：先用5-10mg/L高锰酸钾浸泡软鳍新光唇鱼10-20分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后，以75％酒精再次消毒鱼体后，加入平衡盐溶液消毒液浸泡肌肉组织；浸泡15分钟后，将肌肉组织用消毒液清洗；