[发明专利]一种GelGreen染料在氯化铯密度梯度混合液中对DNA染色的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种GelGreen染料在氯化铯密度梯度混合液中对DNA染色的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

稳定性同位素探针技术(Stable isotope probing,SIP)是一种通过将稳定性同位素作为特定底物对环境微生物进行培养，使微生物在代谢底物的过程中将稳定性同位素结合到核酸(DNA和RNA)和磷脂脂肪酸(PLFA)等特异性生物标志物上，进而将微生物的特性与其特殊新陈代谢功能耦合起来的生物技术。与DNA-SIP相比，PLFA-SIP的不足在于大多数未培养微生物缺乏PLFA分子图式，难以将标记培养得到的PLFA与种属信息联系起来。对于RNA-SIP来说，由于环境样品中mRNA的量很低，很难从超高速密度梯度离心后回收足够下游分析的mRNA，因而限制了RNA-SIP在环境样品中的应用。由于DNA是稳定的遗传物质，携带大量的遗传多样性以及分子生态学信息，在短期SIP培养后能获得目标微生物的DNA，并且通过超高速密度梯度离心的方法将稳定性同位素标记的DNA(即重DNA)从未标记的DNA(即轻DNA)中分离出来，重DNA的遗传多样性能通过下游分析被鉴定，使得DNA-SIP成为耦合微生物遗传多样性与代谢功能最有力的工具之一。

DNA-SIP技术主要包括4个步骤：用稳定性同位素标记的底物培养环境样品；提取培养环境样品总DNA以及超高速密度梯度离心；鉴定重层DNA；重层DNA的下游分析。鉴定重层DNA是DNA-SIP的难点和核心技术。目前用于鉴定重层DNA的方法主要有染色法、同位素比率质量光谱法、指纹分析法、分馏法等，其中染色法由于操作简单方便而被广泛应用。目前染色法所采用的DNA染料主要有两种，分别是溴化乙锭(Stefan Radajewski,P.I.N.R.and J.C.Murrell,Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.Nature,2000.255(5505):p.243-244)和SYBR safe(Martineau,C.,L.G.Whyte and C.W.Greer,Development of a SYBR safe^TM technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.Journal of Microbiological Methods,2008.73(2):p.199-202)。利用溴化乙锭染色，需要大量的DNA(DNA的检出限为15μg)才能使其在紫外光的照射下可见，然而DNA在紫外光的照射下容易突变，影响下游分析。同时溴化乙锭是一种强的诱变剂，可致癌或致畸，这无论对操作人员、周围环境还是受试样品都存在着潜在的损害。与溴化乙锭相比，SYBR safe染料具有更安全的性能，在激发波长为488nm的荧光透射仪的照射下能够使0.5μg的纯菌DNA形成明显的DNA亮带。但是对于环境样品而言，其丰富的物种多样性使得环境样品提取的基因组DNA也较纯菌复杂很多，在超高速密度梯度离心后会形成相对弥散的DNA目的层，从而降低SYBR safe染料对DNA检测的灵敏度，因此限制了其在氯化铯超高速密度梯度离心技术中的应用。与溴化乙锭、SYBR safe染料相比，GelGreen染料是集高灵敏、低毒性和超稳定于一身的极佳的荧光核酸染色试剂，能够检测到更少量的DNA。GelGreen染料的激发波长为488nm，能够在可见光激发的荧光透射仪激发下显色，对实验DNA没有损伤，不影响DNA下游分析，并且对操作人员和周围环境也没有毒害作用，属于环境友好型染料。因此，本发明采用GelGreen染料对环境样品DNA进行染色。