[发明专利]控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D及其标记方法

权利要求书

1.控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D，其特征在于，品种为京411，序列如序列表。

2.控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D，其特征在于，品种为红芒春21，序列如序列表。

3.供控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D的标记方法，其特征在于，步骤包括：

(1)小麦基因组DNA提取；

(2)对检测合格的各样品基因组DNA用限制性内切酶HaeIII，进行酶切，对得到的酶切片段用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，PCR扩增引物：F AATGATACGGCGACCACCGA，R CAAGCAGAAGACGGCATACG，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序；

(3)设计引物TaTGW-2D基因全长引物2D13F：TTCCGTCTCAGAACGACAACA，2D13R：CGCACCAGGCTACAACTCATT，2D19F：GCGTGCTCAGTATGCTTTA；2D19R：AGGCTACAACTCATTCCGA；标记开发引物2DB5F：GCCGCCGATAAGTAGATCTA 2DB5R：ATGGCAGTTCATACCAAAGG

引物2D13、2D19用于扩增TaTGW-2D基因全长，PCR产物克隆测序；引物2DB5用于TaTGW-2D标记开发，依据第三处位于第12内含子内T→C突变，设计标记引物2DB5F，2DB5R，产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳上分离，染色后在紫外光下观察记带。

4.根据权利要求3所述的供控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D的标记方法，其特征在于，(1)小麦基因组DNA提取的步骤包括：

1)将小麦单籽粒磨碎，取0.1g加入0.7mLSDS提取液(0.1M Tris-HCl(PH＝8.5)，0.1M NaCl，0.05M EDTA(PH＝8.0)，2％SDS)在60℃恒温下裂解45min，其间多次震荡；

2)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

3)取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很快分层；

4)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

5)取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转数次；

6)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

7)取上清液加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱静置30min；

9)用70％的乙醇洗涤两次；

10)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

11)沉淀自然风干，4℃存，备用。

5.根据权利要求3所述的供控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D的标记方法，其特征在于，(2)选用拟南芥作为对照进行测序。

6.根据权利要求3所述的供控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D的标记方法，其特征在于，(3)TaTGW-2D标记的PCR反应体系：1μL2.5mM dNTP,0.25μL 10uM引物，1μL 10*La Tap Buffer,0.5U TaKaRa LaTap,100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10uL。

7.根据权利要求3所述的供控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D的标记方法，其特征在于，(3)TaTGW-2D标记的PCR反应程序：95℃变性5min；95℃变性45s；55℃退火50s；72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。

8.根据权利要求3所述的供控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2D的标记方法，其特征在于，(3)琼脂糖凝胶电泳：1.5-2％琼脂糖凝胶，缓冲体系为1×TAE溶液，在100V恒压下，电泳50min，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统扫描并保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳：6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，缓冲体系为1×TBE溶液，电压1200V，电流55A，功率55W，电泳90-110min。