[发明专利]一种利用多聚化合物提高RCA扩增效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用多聚化合物提高RCA扩增效率的方法。

背景技术

核酸扩增技术是一项基本的现代生物技术，广泛应用于生命科学、医疗、农业、环境监测、法医取证等方面。其应用常常基于核酸的检测、鉴定、定量和序列分析，这就要求核酸扩增技术具有高的敏感性、特异性和准确性。由于从生物体内获得的样品DNA往往是极少量的，因此，开发高效率的核酸扩增技术十分关键。

1983年，Mullis等发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，该技术通过若干基本反应的不断循环实现了DNA扩增，使得DNA的产量以指数形式不断增加。但是PCR方法仍然有不足之处如：PCR过程需要反复热循环无法摆脱依赖精良仪器设备的局限；易产生非特异性扩增而导致产生假阳性或假阴性结果；不适用于全基因组扩增等。

与PCR技术相比，目前开发的许多恒温扩增技术具有快速高效，且避免对热循环仪的需要等优点。这些技术包括依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence based amplification，NASBA)、转录介导扩增(transcription-mediated amplification，TMA)、环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)、链替代扩增(strand displacement amplification，SDA)、解链酶扩增(helicase-dependent amplification，HDA)和滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)等。其中，滚环扩增技术作为一种简单高效的核酸扩增手段，具有反应条件温和、引物设计简单、引物末端易固定和产物分析手段多样等优点，目前在核酸测序、全基因组扩增、基因诊断、单核苷酸多态性、蛋白质芯片分析等方面应用广泛。

近年来，基于细菌噬菌体Phi29DNA聚合酶和六碱基随机引物的多引物RCA技术生产的TempliPhi^TMDNA测序模板扩增试剂盒，可从1-100pgDNA的起始材料，经4-6小时反应获得3-4μg高纯度的DNA。该试剂盒可扩增质粒、噬菌体DNA、人工细菌染色体(Bacteria artificial chromosome,BAC)、粘粒等大的环状DNA，对于无法克隆的环状模板，也可用此法进行体外增殖。而且得到的高质量DNA产物是加入的扩增模板的串联重复拷贝，是高分子量的线性双链，可直接用于测序、酶切或其他克隆、标记和检测等方面。

然而，在实际应用中，现有的RCA技术仍存在一定的不足，如反应速度慢、灵敏度低等问题。尤其体现在病毒的早期诊断中，由于反应体系中DNA模板复杂或含量很低，大量引物不能与模板有效配对，使得引物之间易形成二聚体结构，导致错配的产生，从而降低了RCA的扩增效率。目前，有一种使用单链结合蛋白TthSSB来提高RCA扩增效率方法。但是，该方法需要先纯化出有活性的TthSSB蛋白，步骤繁琐、费时费力。因此，在本领域中，需要开发一种简单、快速、高效的提高RCA扩增效率的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用多聚化合物提高RCA扩增效率的方法。

本发明是这样实现的：一种利用多聚化合物提高RCA扩增效率的方法，包括以下步骤：

(1)分别配置浓度为0.1g/ml的PEG 3350、0.2mg/l的mPEG-SC 2000和0.1mg/l的mPEG-SC 5000三种溶液，备用；

(2)使用TempliPhi^TMDNA测序模板扩增试剂盒：

A.变性：以pUC 19质粒DNA作为模板，在5μl样品缓冲液中加入1ng pUC 19质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；

B.培育：在5μl反应缓冲液中加入0.2μl Phi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5μl预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在各RCA反应液中分别加入预设体积的PEG 3350溶液、mPEG-SC 2000溶液、mPEG-SC 5000溶液；各RCA反应液分别于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；分别3μl RCA产物以1％琼脂糖凝胶取3μl反应混合液于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。

进一步地，所述步骤B中，PEG 3350溶液加入量为0.5μl、2μl或4μl。