[发明专利]抗艾滋病药物筛选方法在审

专利信息
申请号: 201510207171.6 申请日: 2015-04-28
公开(公告)号: CN104911259A 公开(公告)日: 2015-09-16
发明(设计)人: 蒋才武;黄健军;伍人杰;伍丹玉 申请(专利权)人: 广西中医药大学
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68
代理公司: 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 代理人: 罗保康
地址: 530200 广西壮族自治*** 国省代码: 广西;45
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摘要:
搜索关键词: 艾滋病 药物 筛选 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及生物医药领域,具体涉及一种抗艾滋病药物的筛选方法。

背景技术

获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS,音译为艾滋病),是一种由人类免疫缺乏病毒(简称HIV)的反转录病毒感染后,因免疫系统受到破坏,逐渐成为许多伺机性疾病的攻击目标,促成多种临床症状,统称为综合症,而非单纯的一种疾病,是一种恶性传染病。2013年世界卫生组织公布称全球有200多万年龄在10岁和19岁之间的青少年携带艾滋病毒,另有数百万青少年面临着感染危险;另外,据国家卫生计生委公布,截至2013年9月30日,全国共报告现存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人约43.4万例。

目前,艾滋病疫苗尚未研制成功,药物治疗是用于抗AIDS和HIV感染的主要手段, 经美国FDA 批准上市的抗HIV药物已有30多种。临床上治疗AIDS和HIV 感染所采用的高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retrovirus therapy, HAART)可以降低病毒对免疫系统的损害,一定程度上恢复其免疫功能,提高AIDS患者和HIV携带者的生存时间和生活质量。但是,由于HIV的高度变异性使HAART的治疗效果不稳定,目前已上市的药物不能将HIV病毒完全清除,而且毒副作用严重,影响患者对治疗方案的依从性。因此,急需寻找高效、低毒的新型抗艾滋病药物。

HIV-1逆转录酶(RT)是一个由P66和P51亚基组成的异二聚体酶,由HIV pol基因编码,分别有560和440个氨基酸残基。是一种具有RNA引物RNA依赖的DNA聚合酶活性(RDDP)和DNA依赖性DNA聚合酶活性(DDDP)和核糖核酸酶(RNase)H活性多功能酶,在HIV-1生命周期早期过程中发挥重要作用。

目前感染的艾滋病毒主要是HIV-1病毒,HIV-1病毒由两条单链RNA组成,以氢键相连接稳定存在于衣壳蛋白内。HIV-1的基因组很小,不到10 kb,在5’端有帽结构,3’端有poly(A)尾巴。在 HIV感染的过程中,逆转录酶 (reversetranscriptase, RT)、整合酶(integrase, IN)、蛋白酶(protease, PR)三种关键酶在整个HIV生命周期中起到决定性作用。

逆转录是病毒细胞核分解后,在RT的手掌区,以单链病毒基因RNA引物结合部位(viral primer binding site, PBS)为模板、以细胞的t RNA的3’端为引物,在RT的RNA 依赖的 DNA 聚合酶(RNA-dependent DNApolymerase,RDDP)活性作用下,合成 RNADNA杂交链,继而在RT的核糖核酸酶H(RNase H)活性下,剪切下RNA,保留DNA单链,再以DNA负链为模板,在RT的DNA依赖的DNA聚合酶(DNA- dependent DNA polymerase,DDDP)活性作用下,合成DNA双链,再经过DNA整合酶的作用整合到宿主细胞的DNA上,病毒基因就会进入到宿主细胞的DNA中。在此过程中可能产生病毒的突变体。在病毒的蛋白质整合酶与宿主的DNA修复酶共同作用下,病毒基因组与宿主DNA连接起来,形成宿主染色体DNA。

寻找高效、低毒的抗艾滋病药物,始终是本领域的研究热点,目前国内抗艾滋病药物的筛选方法层出不穷,仍鲜有简便、高效筛选抗艾滋病药物的方法报道。

发明内容

针对上述不足,本发明提供一种抗艾滋病药物的筛选方法,可以有效、快速的完成抗艾滋病药物的筛选。

本发明提供一种抗艾滋病药物的筛选方法,包括以下步骤:

(1)制备模板和引物:在对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点,以PBS为模板、以PBS互补的DNA为引物;所述的PBS模板是2uL 1mM 21 nt HIV RNA template( 3’-ACAAGC CCGCG GUGAC GAUCU-5’),所述的DNA引物为1uL 1mM 11 nt DNA primer (5’-γ-32P-TGT TCG GGC GCC A-3’);

(2)依次加入97μL H2O,70℃,10 min, 缓慢冷却到室温;

(3)取template/primer溶液1uL,依次加入缓冲液,水,DTT, dNTPS、药物、HIV RT。

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