[发明专利]一种微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法在审
申请号: | 201510207451.7 | 申请日: | 2015-04-28 |
公开(公告)号: | CN104789681A | 公开(公告)日: | 2015-07-22 |
发明(设计)人: | 方雪恩;王丽娟;陈旭;徐凌佳;孔继烈 | 申请(专利权)人: | 上海速芯生物科技有限公司;复旦大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 200434 上海市*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 微小 反应 体系 水平 核酸 恒温 扩增 检测 方法 | ||
1.一种微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法,其特征在于,具体步骤如下:
1)在200μl的PCR管中配制微小反应体系:
引物液:0.36-1.44μl,反应液:3.04-12.16μl,DNA聚合酶:0.2-0.8μl,SYTO-9:0.2-0.8μl,待检DNA:0.2-4.8μl,用DNase/RNase-Free蒸馏水补齐到5-20μl;
2)恒温检测反应:设置阳性对照反应时,用含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA,设置阴性对照反应时,用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混匀后离心,并于温度设置为60-65℃的PCR仪上反应45-90min,并在80℃下持续反应2min;
3)结果判断:在上述PCR管中加入2μl荧光显色剂,混匀,阳性质粒显现为绿色,阴性质粒显现为橙色,且阳性质粒显现S型扩增曲线,阴性质粒显现直线扩增曲线,阳性质粒、阴性质粒在该微小反应体系水平上均实现正常扩增。
2.根据权利要求1所述的微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法,其特征在于,所述引物液包含50μM第一外引物、50μM第二外引物,50μM第一内引物、50μM第二内引物;
所述第一外引物为TAAGTATTTGGGAGAAGGGA;
第二外引物为AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA;
第一内引物为
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA;
第二内引物为GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG;
所述反应液包含12mM的dNTP、等温扩增反应缓冲液、150mM的硫酸镁水溶液,dNTP、反应缓冲液体积比是8:5:2;
所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶,浓度为8U/μl;
所述核酸中阳性质粒为含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA,阴性质粒为不含目的基因的反应混合液;
所述荧光显色剂为SYTO-9。
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