[发明专利]一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可注射水凝胶的制备方法，特别是一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，属于生物医用材料制备技术领域。

背景技术

软骨是一种无血管、神经和淋巴腺的组织，主要由一些稀疏的软骨细胞包埋在较为密集的细胞外基质中组成。这种特殊的组织结构，使得软骨对于损伤的自修复能力极低，如若治疗不恰当，可能会导致严重的功能障碍。临床上，由各种原因引起的软骨损伤十分常见。

目前，临床上常用的用于关节软骨修复的方法主要有微骨折法、自体软骨移植和同种异体软骨移植。这些方法虽然在一定程度上降低了软骨损伤带给病人的疼痛感，提高了软骨的部分功能，但是，存在着供体匮乏、机体对植入组织的免疫排斥反应、移植造成的疾病传播等缺点，难以满足临床需要。

近些年来，将软骨细胞在合适的基质中培养增殖，然后移入软骨缺损部位，进行修复的方法成为一种理想的解决途径。这里，基质对软骨的修复效果起着至关重要的作用。在诸多材料形成的基质中，可注射型水凝胶，由于其结构形态更接近于天然软骨基质，能更好地为受损软骨组织提供适合其修复与再生的微环境，同时具有精确填充任意形状和深度的软骨损伤部位、紧密粘合周围组织、微创注入等可注射特性，而成为当前最为理想的软骨修复材料之一。

可注射型水凝胶的制备方法很多，包括化学（或辐射）交联、相转变、分子自组装等。然而，这些制备方法由于存在着诸如交联剂（或引发剂）具有一定的毒性、交联反应时较大反应热的释放、射线对细胞和组织的损伤、原位形成凝胶的时间较长等缺陷，大大限制其在软骨修复中的普遍应用。

原位光聚合的方法制备软骨损伤修复用可注射水凝胶，恰能很好地克服上述诸多缺陷，优势显著。通常，生成这种水凝胶所用的单体一般由含有两个或多个带有光活性基团的水溶性天然高分子或合成高分子单体组成。然而，由单一的合成高分子单体所形成的原位光聚合水凝胶，表面缺乏细胞可以识别的位点，不利于细胞特异性黏附及特异基因的激活；而由单一的天然高分子单体所形成的原位光聚合水凝胶机械强度差，不足以匹配软骨组织。虽然研究者们做了改进，构建了系列光聚合天然高分子-合成高分子杂化水凝胶支架，然而，这些杂化水凝胶支架，由于微环境中合成高分子的引入，致使整个支架材料的生物活性显著降低，与全天然高分子水凝胶支架相比，在促进软骨细胞的黏附、生长与增殖方面，差距明显。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种生物相容性好、强度高的仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法。

为了实现上述目的，其技术方案如下。

一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，所述制备方法按以下步骤进行：

a. 马来酰化甲壳胺的制备

将甲壳胺和马来酸酐置于非质子溶剂中，甲壳胺与非质子溶剂质量体积比为1：10～200，甲壳胺分子链上氨基与马来酸酐的酸酐基摩尔比为1：0.1～10，室温下搅拌均匀，在25～90℃条件下反应，反应时间为12～48小时，反应结束后，在甲壳胺、马来酸酐、非质子溶剂形成的混合溶液中加入无水丙酮至混合溶液无沉淀析出为止，收集沉淀物，沉淀物在室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.05～0.5的马来酰化甲壳胺。

b. 甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒的制备

将甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺分别置于甲苯中，甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺的摩尔比为1：1.1：1.1，甲基丙烯酸羟乙酯与甲苯的体积比为1：10，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，将甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液，按去离子水、1 mol/L盐酸、1 mol/L氢氧化钠溶液的顺序对甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液进行洗涤，分液得上层亮黄色液体，亮黄色液体在35℃条件下真空干燥24h，得到丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

将丝素蛋白纳米微粒和上述丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯分别置于非质子溶剂中，丝素蛋白纳米微粒与非质子溶剂重量体积比为1：50～200，丝素蛋白纳米微粒分子链上氨基与丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯丙烯酰基摩尔比为1：1～20，室温下搅拌均匀，在25～70℃条件下反应，反应时间为12～24小时，反应结束后，在丝素蛋白纳米微粒、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯、非质子溶剂形成的固液体系中，加入无水丙酮至固液体系中无沉淀析出为止，收集沉淀物，沉淀物在室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.04～0.2的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。

c. 仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备