[发明专利]抗美沙酮代谢物EDDP杂交瘤细胞株及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗美沙酮代谢物EDDP杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体的应用。

背景技术

美沙酮代谢物EDDP即为美沙酮在肝脏内经生物转化，通过去甲基化形成无药理活性的吡咯烷(pyrrolidine)衍生物，其化学名为2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP)。

美沙酮是一种人工合成的麻醉药品，属于国家严格管制的麻醉药品之一。美沙酮可以用来治疗海洛因及鸦片成瘾。美沙酮是一种长效阿片类药物，和海洛因等毒品不同，吸毒人员服用美沙酮后，不会产生对毒品的依赖，也就是说不会产生毒品戒断后的痛苦症状，由于美沙酮是特殊药品，所以对它的保管特别严格，一旦有人非法带出医院，将视为携带毒品送交公安部门处理。通过检测美沙酮代谢物EDDP来确定是否服用美沙酮。

现有技术中，美沙酮可以采用仪器分析。仪器分析依赖技术要求高、检测时间长、成本高，检测结果可靠性不高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗美沙酮代谢物EDDP杂交瘤细胞株。

本发明抗美沙酮代谢物EDDP杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株9G2.5，于2015年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:C201507；保藏地址是中国武汉武汉大学。该杂交瘤细胞株能够产生高特异性的抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体，生产效率高，成本低。

本发明的另一个目的是提供杂交瘤细胞株9G2.5分泌的抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体。该单克隆抗体具有较高的特异性、敏感性，交叉反应率低。

本发明的第三个目的是提供抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体的制备方法，包括步骤如下：

步骤(1).小鼠免疫

选择8周龄的BALB/c雌鼠用美沙酮代谢物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；

取8周龄的BALB/c雌鼠，用美沙酮代谢物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉，每隔1周注射一次，共注射4次；第一次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量为20μg/只，第一次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫之前进行抗原乳化步骤，抗原乳化步骤是将美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量稀释于20ulPBS缓冲液中，得到稀释抗原,与等体积量的弗氏完全佐剂乳化；后续二次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量为20ug/只，抗原乳化步骤与第一次相同；最后1次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量改为5ug/只，抗原乳化步骤与第一次相同。

步骤(2).淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合

2-1.饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75﹪酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；离心，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。

2-2.小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10﹪FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。

2-3.淋巴细胞制备：取经步骤(2)处理的BALB/c雌鼠靠近淋巴结皮下部位的淋巴结，研磨淋巴细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入IMDM培养基，调整淋巴细胞的浓度至1×10⁷个/mL。

2-4.淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法。将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入1mL 37℃预温的PEG 1450，再加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤2-1的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO₂培养箱中培养。

步骤(3).杂交瘤细胞的筛选

3-1.初筛：