[发明专利]一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法

权利要求书

1.一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其包括下列步骤：

1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；

2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：

引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，

引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，

引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，

引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，

引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，

引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，

引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，

引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，

引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，

引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，

所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示；

3）获得S1至S10片段的cDNA；

4）分别以步骤3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；

5）将步骤4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT-S1、pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：

S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；

S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；

S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；

S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；

S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；

S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；

S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；

S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；

S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；

S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；

6）将步骤5）中获得的pT-S1至pT-S9重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S1至S9片段的RNA，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：

重组质粒pT-S1用SacII进行酶切；

重组质粒pT-S2用SacII进行酶切；

重组质粒pT-S3用SacII进行酶切；

重组质粒pT-S4用SacII进行酶切；

重组质粒pT-S5用SacII进行酶切；

重组质粒pT-S6用SacII进行酶切；

重组质粒pT-S7用XbaI进行酶切；

重组质粒pT-S8用SacII进行酶切；

重组质粒pT-S9用SacII进行酶切；

7）构建带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT-S10-DsRed，将其进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S10-DsRed RNA，其中所述红色荧光蛋白基因的5'端带有对应于家蚕质型多角体病毒基因组S10片段的5'非编码区的cDNA序列、3'端带有对应于S10片段的3'非编码区的cDNA序列，所述重组质粒pT-S10-DsRed用SacII进行酶切；

8）将步骤6）中获得的S1至S9片段的RNA及步骤7）中获得的S10-DsRed RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，待观察到宿主的细胞内发出红色荧光时，收集细胞并粉碎，离心纯化，获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒。