[发明专利]一种检测甜瓜黄斑病毒的特异性RT-LAMP引物组及其RT-LAMP检测试剂盒和RT-LAMP检测方法

权利要求书

1.一种检测甜瓜黄斑病毒的特异性RT-LAMP引物组，其特征在于，其包括如下4条引物：

F3:5’-CRCTCTGCCCTGTTGTYC-3’；

B3:5’-ACTGGTTGTTCCTGGTTTG-3’；

FIP:5’-CAATTTTGCAGATCTGCTCATATGTTRCCTTTGGCCTATTTYCAG-3’；

BIP:5’-CTCGYGTTATGTCTGCTAGCAATTCAGCCAAGATYTTCACACAA-3’；

其中，R代表A或G，Y代表C或T，K代表G或T。

2.一种含有权利要求1所述特异性RT-LAMP引物组的检测试剂。

3.一种含有权利要求1所述特异性RT-LAMP引物组的甜瓜黄斑病毒的RT-LAMP检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，还包含RT-LAMP反应液，RT-LAMP反应液和特异性RT-LAMP引物组的混合液组成RT-LAMP检测体系，20μL RT-LAMP检测体系包括以下溶液：

(1)4μL溶液A：5×LAMP反应液：10.0mM Tris-HCl，5.0mM(NH₄)₂SO₄，25.0mM KCl，5.0～10mM MgSO₄，0.05％吐温20，5.0mM dNTPs，0.5U/μL逆转录酶AMV RTtase，0.5U/μL热启动等温扩增酶；

(2)4μL溶液B：5×引物混合液包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；其中，外引物和内引物的浓度之比为1:3～10；

(3)11μL溶液C：去除核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的超纯水；

(4)1μL样品总RNA。

5.根据权利要求4所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP检测体系中外引物F3、B3的浓度均为0.2μM，内引物FIP、BIP的浓度均为0.6～2.0μM。

6.一种甜瓜黄斑病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品总RNA作为反应模板；

2)配制RT-LAMP检测体系：

按总反应体积为20μL为例，4μL溶液A：5×LAMP反应液：10.0mM Tris-HCl，5.0mM(NH₄)₂SO₄，25.0mM KCl，5.0～10mM MgSO₄，0.05％吐温20，5.0mM dNTPs，0.5U/μL逆转录酶AMV RTtase，0.5U/μL热启动等温扩增酶；4μL溶液B：5×引物混合液包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；其中，外引物和内引物的浓度之比为1:3～10；11μL溶液C：去除核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的超纯水；1μL样品总RNA；

3)取1μL步骤1)提取的样品总RNA加入到步骤2)配制RT-LAMP检测体系中，混匀，在63～65℃恒温进行RT-LAMP反应，反应60min，80℃Bst失活10min；

4)结果诊断：将2μL步骤3)扩增后的反应液电泳检测或加入绿色荧光染料显色，电泳检测有梯子状条带或紫外灯下加入绿色荧光染料显色为绿色荧光的样品表示含有甜瓜黄斑病毒；无条带或紫外灯下不显色，判断为不含有甜瓜黄斑病毒。

7.根据权利要求6所述的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于，所述RT-LAMP检测体系中外引物F3、B3的浓度均为0.2μM，内引物FIP、BIP的浓度均为0.6～2.0μM。

8.如权利要求6所述的RT-LAMP快速检测方法在甜瓜黄斑病毒检测中的应用。

9.如权利要求6所述的RT-LAMP快速检测方法在甜瓜、黄瓜上的甜瓜黄斑病毒病检测中的应用。