[发明专利]用于肉制品中鸭源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR方法及其引物和锁核酸探针序列

说明书

技术领域

本发明涉及动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及用锁核酸探针荧光定量PCR检测肉制品中鸭源性成分的方法及其引物和锁核酸探针序列。

背景技术

由于肉价差巨大，利益的诱惑导致肉类食品“掺假使假”事件频发，2013年的欧洲马肉丑闻席卷了瑞典、英国、法国、爱尔兰、荷兰、罗马尼亚等多个国家，引起了各国人民的不安与愤懑，也引起了各国政府的重视而纷纷开展肉食品“掺假使假”调查。BALLIN等对近千种肉制品的检测发现，有近20%的产品存在标识与品种不完全相符现象。2013年上海市食安办在查处问题羊肉时意外发现猪肉鸭肉掺假。山东郓城警方捣毁一处生产加工伪劣牛羊肉卷的窝点时发现“肥牛”实为牛肉加牛脂肪再加鸭肉做成，“羔排”是羊肉和鸭肉的混合产品，而鸭肉的掺杂比例最高达70%。2014年羊城晚报委托某机构对珠海部分农贸市场出售的“肥羊”进行检测，结果显示送检的7份产品全部涉嫌掺假，除了羊肉，这些产品还掺杂了牛肉、鸭肉和马肉。因此，打击肉制品掺假成为近年来我国肉制品监管的重点，而打击肉制品掺假首先需要对肉制品的肉种成分进行快速鉴别。

对肉制品的肉种成分鉴别主要基于对动物源性成分的鉴别。虽然动物源性成分的鉴别方法很多，但以检测DNA为基础的分子生物学方法，尤其是PCR技术以稳定、准确、快速等优势而得到广泛的应用。然而，食品中DNA成分复杂，加之PCR技术的高灵敏度，使得应用PCR方法来鉴别物种存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，以PCR为基础，应用改良的引物探针设计策略已逐步成为肉类鉴别的新方向。

锁核酸探针荧光探针是在Taqman探针的基础上，有目的地将探针的一些碱基修饰成LNA碱基，而每增加一个单体LNA分子可提升Tm值3-8℃,还可通过调整LNA碱基在探针中的位置来调节最佳Tm值和锁核酸探针杂交的特异性，从而增加探针的稳定性、特异性和设计的灵活性。目前，锁核酸探针荧光定量PCR已在病原检测、基因突变检测等方面得到广泛应用。本研究利用锁核酸探针荧光探针的上述优点，建立肉制品中鸭源性成分的锁核酸探针荧光定量PCR检测方法，为动物源性成分的检测提供了新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于肉制品中鸭源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR方法及其引物和锁核酸探针序列。包括：

⑴所述的引物和锁核酸探针的序列：

上游引物：5’-ACCTTCCCGCACCCTCTAAT-3’；

下游引物：5’GGCAGATGGCGAGCAGAGAT-3’；

锁核酸探针：

5’-CY5-ATCTCYG+CYTGATGAAACTTCGG-BHQ3-3’

(2)采用步骤(1)设计的引物和探针建立鸭源性成分的锁核酸探针荧光PCR检测方法。其特征在于：荧光PCR检测的反应体系为：20μL，包括10μLProbesMaster2×conc(包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等)，步骤(1)设计的10μmol/L上下游引物F/R各0.8μL，10μmol/LTaqman-LNA探针P0.3μL，DNA模板1μL，超纯水补至20μL。反应参数：95℃8min；95℃，8s，58℃，25s（采集荧光信号），35～40循环。

基于本发明建立的锁核酸探针荧光PCR检测方法，按下列步骤进行：

1）样品的制备与DNA模板的提取：

取上述样品25g，剪碎后，加去离子水制成1:4匀浆，吸取匀浆50μL于1.5mL离心管内，按组织核酸提取（离心柱法）试剂盒使用说明操作，提取DNA备检。

2）将试剂从冰箱取出后，置室温融化，8000rpm离心10sec。根据样品数按下表计算试剂用量。