[发明专利]一种利用外源动物线粒体DNA检测地沟油的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种检测地沟油的方法，尤其是一种利用外源动物线粒体DNA检测地沟油的方法。

技术背景：

“地沟油”又称为潲水油、泔水油，是质量、卫生极差，过氧化值、酸值、水分、羰基价、丙二醛等指标严重超标的非食用油。其来源主要有：下水道中的油腻漂浮物；将宾馆、酒楼的剩饭、剩菜经过简单加工、提炼出的油；用于油炸食品的油使用次数超过规定要求，或是劣质猪肉、猪内脏、猪皮加工以及提炼后产出的油。被捞回的“地沟油”通常会在勾兑一些新油之后流入食品、餐饮行业。地地沟油中重金属、毒素(如丙烯醛、黄曲霉毒素)、过氧化值等都严重超标，并含有洗涤剂等类化学杂质，对人体具有很大危害性，食用后会引起呕吐、头痛、腹泻等不良反应，长期摄入会使细胞功能衰竭，甚至可成为癌变诱因。

目前，地沟油检测的方法主要有以下几种：1、根据酸价、过氧化值等理化指标进行检测；2、根据地沟油中含有重金属进行检测；3、根据地沟油中含有的动物油脂，通过其胆固醇含量进行检测；4、利用电导率法进行检测；5、利用薄层色谱法对地沟油经高温加热或反复使用后产生的极性物质进行检测；6、利用荧光法检测地沟油外源性污染物质特性(餐具洗涤剂表面活性剂十二烷基苯磺酸钠)的特征荧光波峰为检测对象进行地沟油的检测。

上述利用地沟油中的外源性物质进行检测方法，由于检测对象含量很少，同时该检测对象无法被有效放大，因此检测的灵敏度不高，准确度不高。

现有技术中，也公开了一些克服上述不足的技术方案，主要是以地沟油中含有的外源性动物DNA作为检测对象，借助现有的核酸扩增手段，有效放大核酸信号，提高了检测的灵敏度及准确度。

朱旭平等(专利CN101906471A)根据动物线粒体CYTB基因的保守区设计特异性引物，利用荧光定量PCR进行检测，根据结果绝对Ct值进行判定；郭新东等(专利CN102758025A)根据动物物种牛、羊、猪、鸡保守序列分别设计引物，利用PCR扩增，根据电泳产物进行判定；邓平建等(CN103290103A)利用PCR对猪、牛、鸡、哺乳动物等的看家基因进行检测，根据待检油样的扩增DNA片段是否包含一个或多个物种特异性看家基因片段来判定。利用外源动物DNA进行检测，特异性强，灵敏度高，但上述方法中利用结果绝对Ct值进行判定，无法避免检测过程中人员操作，环境等对实验结果的影响，判断存在误差，结果稳定性不高；针对多个检测靶标设计多对引物，成本高，反应体系复杂，结果判定不够准确。

发明内容：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种利用外源动物特征DNA检测地沟油的方法，来解决现有技术灵敏度不高，稳定性不好，准确度低，成本高的问题。

一种利用外源动物线粒体DNA检测地沟油的方法，为对待检油提取DNA后，以所提取的DNA为模板，利用实时荧光定量PCR扩增动物线粒体DNA片段，所述动物线粒体DNA片段的核苷酸序列为SEQIDNO:1。

为对待检油提取DNA后，以所提取的DNA为模板，利用实时荧光定量PCR扩增植物叶绿体DNA片段，所述植物叶绿体DNA片段的核苷酸序列为SEQIDNO:2。

以植物叶绿体DNA片段扩增结果为质控线，所述质控线用于检验数据是否可用，以终浓度为10^-17M的动物组织DNA标准品Ct值为检测限，当待检测油动物线粒体DNA扩增结果Ct值相对位置在检测限前，即为地沟油。

所述待检测油动物线粒体DNA片段扩增与所述植物叶绿体DNA片段扩增在相同条件下，同时进行。

所述动物线粒体DNA片段的核苷酸序列SEQIDNO:1为：

GGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTGATGGTGCAACCGCTATCAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATCT

所述植物叶绿体DNA片段的核苷酸序列SEQIDNO:2为：

GCACCCTAGATGGCGAGAGTCCAGTAGCCGAAAGCATCACTAGCTTACGCTCTGACCCGAGTAGCATGGGGCACGTGGAATCCCGTGTGAATCAGCAAGGACCACCTTGCAAGGCTAAATACTCCTGGGTGACCGATAGTGAAGTAGTACCGTGAGGGAAGGGTGAAAAGAACCCCCATCGGGGAGTGAAATAGAACATGAAACCGT

根据动物线粒体DNA片段的核苷酸序列SEQIDNO:1获得的动物序列扩增引物序列可以为：