[发明专利]几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用。

背景技术

几丁质(chitin)，俗称甲壳素、甲壳质，由N-乙酰葡萄糖胺单体以β-1，4-糖苷键连接起来的直链多聚物，是自然界中含量最丰富，海洋环境中仅次于纤维素的第二大可再生资源。几丁质广泛存在于甲壳纲动物虾蟹、昆虫的甲壳，以及真菌(酵母，霉菌)、藻类、植物的细胞壁中。据估测，海洋环境每年超过10¹¹吨几丁质形成，其降解主要是通过产几丁质酶的微生物完成。

微生物几丁质降解系统主要由内切几丁质酶(chitinase，EC 3.2.1.14)、外切几丁质酶(chitinase，EC 3.2.1.14)、β-N-乙酰己糖胺酶(β-N-acetylhexosaminidase，EC 3.2.1.52)与几丁质结合蛋白(chitin-binding protein,CBP)等组成。内切几丁质酶在高聚几丁质链内随机切割生成几丁质寡糖(chitooligosaccharides,(GlcNAc)_n,n>2)；外切几丁质酶有两种，分别从高聚几丁质链的还原端和非还原端依次切割下(GlcNAc)₂；β-N-乙酰己糖胺酶将从非还原端将几丁质寡糖切割成为GlcNAc。其中几丁质结合蛋白(chitin-binding protein,CBP)，起到分散几丁质糖链束的作用，对于不溶多糖降解起着决定性的作用。几丁质结合蛋白是一类能与几丁质特异结合的蛋白质，广泛存在于各种微生物、动物和植物中。但是目前人们对于假交替单胞菌及其几丁质酶蛋白的认识还有限，现有的一些几丁质蛋白的生物活性及其表达仍不理想，还有一些几丁质蛋白对活性存在条件苛刻，制备、保存成本高，这些因素对于几丁质蛋白的应用造成限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有高效抗病原真菌活性且制备方法简单、易保存的几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用。

为解决上述问题，本发明采用的构思是：本发明以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株为研究对象，克隆和表达分析了几丁质蛋白的基因，为农业领域抗真菌药物研发的提供新的研究方向，具有广阔的应用价值。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年12月13日，其保藏编号为CGMCC No.8580。

本发明的技术方案如下：一种几丁质结合蛋白CBP58，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白CBP58的制备方法，以假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas sp.DL-6)基因组DNA为模板，以CBP58-F和CBP58-R引物对进行PCR扩增；所述引物为：上游引物CBP58-F:5’-GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGATAGCCCTAAAG-3’下游引物CBP58-R:5’-CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3’。

进一步的，上述几丁质蛋白CBP58的编码基因其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，由531个氨基酸组成。

本发明的另一个目的是提供上述几丁质结合蛋白CBP58的表达与纯化方法，包括以下步骤：

(1)碱基序列扩增：以PCR方法扩增如SEQ ID No.1所示的DNA序列；

(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-CBP58：将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T simple载体用同样的限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T₄DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-CBP58；

(3)构建大肠杆菌重组表达载体：将克隆载体pMD19-T-CBP58质粒转化至E.coli DH5α，得到阳性转化子，用限制性内切酶NdeI和XhoI将CBP58基因片段从pMDl9-T-CBP58质粒上切下，连接到pET-23b表达载体上，转化至E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性转化子克隆，得到重组表达载体pET23b-CBP58；