[发明专利]几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用

说明书

本发明涉及几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用，属于基因工程技术领域。本发明以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL‑6)为研究对象，首次克隆出具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的几丁质酶基因chiC，并获得了高活性几丁质酶，其制备方法简单，生产成本低，产品易保存，适宜的酶解温度是30℃，酶解pH值为9.0，对胶体几丁质具有高降解活性可达1.569±0.017U/ml，几丁质酶chiC降解α几丁质和β几丁质生成几丁二糖，具有工业化生产前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种几丁质酶基因chiC，特别涉及一种来源于假交替单胞菌的新菌株(Pseudoalteromonas sp.DL-6)(CGMCC No.8580)的几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用。

背景技术

几丁质(chitin)，俗称甲壳素，是一种可从虾蟹壳等废弃物中提取的天然多糖，其结构为N-乙酰-D-氨基葡萄糖(50～100％)和少量D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键(0～50％)连接而成，自然界中每年由生物体合成的甲壳素为100-1000亿吨，是海洋环境中含量最丰富，自然界中仅次于纤维素的第二大生物质来源。几丁质降解产物为高附加值的几丁寡糖、几丁单糖及其衍生物等，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、降血压和降低胆固醇等生物活性，已广泛应用于医药、农业、工业和食品等众多领域。

目前，几丁质制备几丁寡糖普遍采用的方法是化学法，即用强酸去除盐类、蛋白等，用强碱去除脂类或脱除乙酰基等。但是该工艺耗能大，反应过程及产物的分子量分布难以控制，最重要的问题是生产过程中排放出大量的废酸碱水，造成了严重的环境污染。因此，寻找一种绿色、高效高产高品质几丁寡糖的方法越来越受重视。几丁质酶(chitinase,chi,EC3.2.1.14)是指专一降解几丁质为几丁寡糖或单糖的一组酶的总称。自然界中，chi广泛存在于细菌、病毒、真菌、昆虫、植物以及动物中，该酶具有重要的生理功能，不同来源的chi，其催化机理和生理功能可能差别很大。细菌产生的几丁质酶可降解几丁质产生碳源和能源，获取自身生长、繁殖所需养料，同时保证自然界中几丁质的循环利用；真菌几丁质酶可实现自身细胞的分裂与形态构建；昆虫等节肢动物分泌几丁质酶满足蜕皮和生长发育的需要；病毒几丁质酶在发病机制中产生；植物分泌几丁质酶却是为了防御病源微生物的侵袭而进行的自我保护；一些原生动物需要几丁质酶消化昆虫的围食膜。人类产生的几丁质酶功能尚未确定，据推测可能与抵抗体内几丁质源的病原体或在碳水化合物代谢过程中发挥生理功能。

几丁质是海洋环境最丰富的资源，据估计10％的海洋细菌依赖几丁质作为碳源和氮源，海洋具有高盐(3.5％)、高压(﹥100Mpa)、低温、低光照、寡营养以及无光照、局部高温(400℃)等极端生态环境，海洋低温chi具有低温下高酶活力及高催化效率、结构高效柔顺性和热不稳定性等生物学特性。复杂多变的生态环境和遗传机制和遗传结构赋予海洋低温chi产生特有的具有不同的聚合度(degree of polymerization，DP)几丁寡糖。几丁质主要来源于海洋生物体，如虾、蟹和藻类和其他软体动物是，因此海洋中积聚着十分丰富的几丁质资源。几丁质资源如果处理不好，不仅造成浪费而且污染环境。海洋低温几丁质酶降解几丁质生产几丁寡糖及其衍生物解释了海洋环境几丁质物质循环的基本规律，不仅为新型海洋微生物资源的开发与利用、海洋环境的保护与治理提供重要的理论依据，而且对于开拓几丁质行业的市场具有应用价值。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的几丁质酶基因chiC，并构建了chiC原核表达载体，获得了高活性的几丁质酶。

为解决上述技术问题，本发明采用的构思是：以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)(CGMCC No.8580)菌株为研究对象，克隆和原核表达了几丁质酶chiC基因，为获得高活性几丁质酶及具有几丁质酶的功能的产品提供了新思路。

本发明采用的技术方案是：