[发明专利]一种甘蔗梢腐病原菌PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘蔗梢腐病原菌PCR检测试剂盒，属于分子生物学PCR遗传鉴定技术领域。

背景技术

甘蔗梢腐病(Pokkah Boeng Disease，PBD)是甘蔗生长中一种发生较普遍的、世界性的甘蔗病害，1921年在印度尼西亚爪哇首次报道。目前，几乎所有甘蔗生产国和地区都有该病发生。我国甘蔗生产区也常有梢腐病发生，福建、台湾、广西、云南、广东以及海南都曾报道过，对我国甘蔗生产和糖业发展带来巨大损失。

甘蔗梢腐病(PBD)主要通过带病植株和气流传播，感病后甘蔗一般表现为梢部和幼叶基部缺绿黄化，叶片扭缠或短缩，有明显的褐色皱纹。发病最严重时形成梢腐，生长点周围组织变软、变褐，心叶坏死，使整株甘蔗枯死。受害蔗株株高比健株平均减少30～60cm，受害蔗田每亩平均减产l～2t，甘蔗糖分降低0.56％左右，重力纯度降低3％左右，造成甘蔗产量和品质下降以及品种种性退化。甘蔗生长最旺盛的7-9月是梢腐病的主要发生时期，高温高湿、干旱后充分灌水、施用氮肥过多或干旱后遇到降雨，都可引发梢腐病的大规模发生。

甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌为Gibberella fujikuroi(Saw.)Wolle，是一种真菌性病害。在我国，甘蔗病害的基础性研究比较薄弱.尤其在甘蔗抗病育种和病害的快速诊断技术上，与先进国家有较大差距。借鉴或引进国外先进病害检测技术和抗性鉴定技术，提高甘蔗抗病育种水平和病害诊断水平，是甘蔗梢腐病研究的重点问题。

甘蔗梢腐病(PBD)的诊断技术经历了从内部症状观察→相差显微镜检查→免疫技术→PCR快速检测4个阶段。我国在这方面的研究比较落后，诊断方法以内部症状观察和相差显微镜检查为主，应用免疫技术和PCR检测PBD还处于起步阶段。20世纪80年代初，免疫学技术在生物医学、动植物病原菌的检测、诊断与防治上得了广泛应用。1984年以来，国外不少学者将免疫技术应用于甘蔗PBD诊断，以广西主栽品种新台糖22(ROC)为研究对象，利用DNA杂交技术(Tissue blot DNA hybridization和ITS序列分析检测甘蔗梢腐病病原细菌Gibberella fujikuroi(Saw.)Wolle，也获得了较理想的效果。PCR技术是20世纪80年代中期建立的一项体外迅速、大量扩增目的基因的技术，已广泛地应用于分子生物学、医学、农学等学科，用于基因的克隆遗传分析和疾病诊断等。由于PCR能够特异扩增某一DNA片段，因此，在病原微生物的检测上，比传统方法有优势，如PCR技术检测生物体时不需要培养，具有极高的灵敏度、快速等。近10多年来，PCR技术在植物病害检测中得到了广泛应用，也有不少学者对甘蔗梢腐病(PBD)分子检测技术进行了研究，如张玉娟利用甘蔗PBD病原细菌的18S-28S核糖体DNA的ITS区域设计了1对特异引物(正向引物为:5'-CTCTTGGTTCTGGCATCG-3'，反向引物为:5'-GTTCAGCGGGTATTCCTA-3')进行PCR检测，检测了14个PBD样本，获得了大小为545-546DNA特异扩增产物，ITS序列与镰刀菌同源性高达99％。

等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。环介导核酸等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，就是等温PCR技术的一种，是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。

但迄今为止，市面上尚未用于甘蔗梢腐病原菌检测的PCR试剂盒。本发明研制出一种检测甘蔗梢腐病原菌PCR试剂盒，为我国甘蔗科研、检疫、质检等部门提供快速、灵敏、准确的病害检测试剂盒产品和技术服务。

发明内容

本发明的目的，是提供一种甘蔗梢腐病原菌PCR检测试剂盒。该试剂盒用于甘蔗梢腐病原菌的检测，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，且检测结果准确、客观、快捷。