[发明专利]用于胚胎发育质量评估的精子长非编码RNA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种用于胚胎发育质量评估的精子长非编码RNA检测方法。

背景技术

胚胎质量评估方法的优劣直接关系到辅助生殖临床妊娠结局的好坏。目前，在胚胎质量评估方法中，应用最广泛的是对配子胚胎各时期的形态特征进行评分的形态学评价法。主要通过观察胚胎的发育与碎片化等指标进行评价，缺乏客观的评价指标。

文献“精子RNA的研究进展”（《癌变·畸变·突变》，2011第23卷，第5期）公开了精子RNA在精子的运动、获能、受精和胚胎发育等过程中起着非常重要的作用。精子RNA可以作为衡量精子质量、预测精子受精能力的一个重要指标，同时，能够影响受精后胚胎的发育，对早期胚胎发育起到重要作用。

通过基因芯片等技术，国外文献“Human reproduction update”（Human Reprodtion Update，2013 19(6) 602-24）报导了通过检测精子中的RNA分子检测弱精子症、畸形精子症等精子形态与活动度的异常。目前已知的标记物如PRM1、TSSK6、miRNA-Let-7d等的差异表达可用于区分精子运动异常。尽管精子的转录本中可以检测到近3000个RNA分子，然而，目前还没有通过芯片筛选找到可靠的基因指标，是否有单个RNA分子可以作为胚胎发育的指标仍然不清楚，还不能从精子RNA中找到表达具体的RNA分子并证实其对胚胎发育的作用。

发明内容

针对现有的辅助生殖技术对胚胎发育缺乏客观评价指标的问题，本发明提供了一种用于胚胎发育质量评估的精子长非编码RNA检测方法。临床通过精子的分子标记物长非编码RNA分子LA16c390E6.5（Ensembl数据库，基因登录号：ENSG00000261641）能准确的预测胚胎发育的潜能，并对疗效检测与辅助生殖方式的选择有指导意义。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

用于胚胎发育质量评估的精子长非编码RNA检测方法，其特征在于：提取受试者精液中的RNA，进行反转录反应，得模板cDNA进行实时荧光定量PCR，检测长非编码RNA分子LA16c390E6.5的表达与正常精子样本进行比较；所述LA16c390E6.5的基因序列为：SEQID NO:1。

在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

本发明所述的实时荧光定量PCR反应采用SYBR Green染料法。

本发明所述实时荧光定量PCR反应的引物，

上游引物为（SEQID NO:2）：CTCAACATCACAGCACAGGG；

下游引物为（SEQID NO:3）：AGCTGCTTGGCCTCATTTTC。

上述引物为特异的针对LA16c390E6.5的荧光探针，通过荧光定量PCR的原理，特异的扩增出针对该长非编码RNA的相对于管家基因（actin）的相对表达量。

优选地，所述的反转录采用TAKARA公司的反转录试剂盒，货号为RR037A。

本发明通过基因表达芯片和长非编码芯片（ArrayStar 长非编码基因芯片系统），筛选出在正常胚胎与低质量胚胎的男性精子样本中差异表达最显著的长非编码RNA分子LA16c390E6.5，并通过扩大样本得到了验证。有益效果在于：

1、目前的胚胎质量评估方法无法做到定量地对胚胎发育进行客观评价，本发明的检测方法从精子的非编码RNA的表达量入手，检测所需的样本量少，速度快，时间短，对预测胚胎的发育潜能的特异性高，检测方法标准化，易于临床推广。

2、本发明首次提出精子长非编码RNA LA16c390E6.5作为预测导致不明原因胚胎停滞发育的男性不育患者的检测指标，并通过临床样本予以进一步的证实，为临床诊断和治疗原因不明的胚胎发育停止提供明确的依据。

3、对于精子中长非编码RNA LA16c390E6.5指标检测异常的男性病人，可以通过治疗与干预后，通过检测该指标的变化指导是否适合做辅助生殖技术的周期。

附图说明

图1为胚胎发育质量高和低的精子样本分别经本方法检测得到的长非编码RNA分子LA16c390E6.5相对表达量的分布图。

其中，ctl为高胚胎质量组，p为低胚胎质量组。

图2为精子长非编码RNA LA16c390E6.5 的表达变化与胚胎质量的生存曲线的分析结果图。