[发明专利]一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用

权利要求书

1.一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，包括如下步骤：

步骤一：双元质粒载体pMuDR构建：以phMR53质粒为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收mudrA基因的全长cDNA片段；用Pst I限制性内切酶对mudrA基因的全长cDNA片段酶切，然后与用Pst I限制性内切酶对pAHC20质粒酶切去除Bar基因的pAHC20(Bar^－)载体片段连接获得pAHC20(Bar^－mudrA⁺)；用EcoR I和Hind III限制性内切酶对质粒pCAMBIA1300和pAHC20(Bar^－mudrA⁺)两者双酶切，前者回收载体部分，后者回收Ubi-mudrA-Nos片段，连接构建得双元质粒载体pMuDR；

步骤二：双元质粒载体pMuE构建：设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收Mu1完整片段，用Kpn I分别对回收的Mu1完整片段进行处理和对质粒pCAMBIA1300进行单酶切，然后进行连接，将Mu1转座子片段插入Kpn I位点形成新的携带Mu1转座子的质粒载体pCAMBIA1300(Mu1⁺)；用Hind III和EcoR I限制性内切酶对pAHC20质粒进行双酶切，回收Bar基因表达盒，用BstE II对载体pCAMBIA1300(Mu1⁺)进行单酶切，酶反应后补平粘性末端，然后两者进行连接，将Bar基因表达盒插入Mu1转座子片段内部形成新的双元质粒载体pMuE；

步骤三：将质粒载体pMuDR和pMuE分别导入农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米鲁元92自交系，从后代筛选无选择标记基因的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤一中引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤一中引物在上游和下游引物的5’端均添加了Pst I限制性内切酶位点和保护碱基，保护碱基为引物的5’端的第一个碱基，Pst I限制性内切酶位点为引物的5’端的第二至第六个碱基所在的位点。

4.根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤二中引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤二中引物在上游和下游引物的5’端均添加了Kpn I限制性内切酶位点和保护碱基,保护碱基为引物的5’端的第一个碱基，Kpn I限制性内切酶位点为引物的5’端的第二至第六个碱基所在的位点。

6.根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤二酶反应后补平粘性末端为采用PfuDNA聚合酶补平粘性末端。

7.根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤一和步骤二PCR扩增的反应体系为：50μl反应体系5U Taq，0.2mmol/L dNTPs,1×Taq buffer,引物各10μmol/L,模板5ng左右；PCR扩增的循环程序：94℃预变性5min,(94℃,30s；53℃，30s；72℃，45s)×30，72℃最后延伸5min。

8.根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤三中从后代筛选无选择标记基因的转基因植株为根据HPT基因序列设计一对引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，采用PCR扩增对转化株进行分子检测筛选。

9.根据权利要求8所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为94℃预变5min；94℃变性，1min；56℃退火1min；72℃延伸1min；35个循环；72℃终延伸10min。

10.权利要求1至9任一项所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法在粮食作物中的应用。