[发明专利]珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用

说明书

本发明公开了一种珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法，属于动物细胞系领域，其为珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系PGSN，已于2015年01月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201505。所述珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法包括以下步骤：1)吻端组织的处理；2)原代细胞培养；3)传代培养。本发明所建立的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系生长状态良好，细胞形态为成纤维样细胞，能稳定增殖并传至70代以上，能大量提供珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供研究平台和实验材料。

技术领域

本发明涉及微生物动物细胞系领域，具体涉及珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用。

背景技术

珍珠龙胆石斑鱼是由鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♂)(俗称龙胆石斑鱼)与棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀)(俗称老虎斑)杂交的新品种，有着老虎斑的头，龙胆石斑鱼的尾巴，显现杂交优势，其肉质细嫩，抗病力强，生长快，已成为我国南方海水养殖业的新宠。近年来，随着养殖石斑鱼规模的不断扩大，集约化程度的不断提高，以及受养殖环境污染、管理技术措施相对滞后等诸多因素的影响，石斑鱼的病害也日益严重。石斑鱼疾病繁多，病原包括病毒、细菌、寄生虫等，尤其是由虹彩病毒、神经坏死病毒引起的病毒病最为严重，一旦暴发就会造成大规模死亡甚至全军覆没，每年因其造成的直接经济损失亿元以上，已经成为石斑鱼养殖业健康发展的重要制约因素之一。

细胞系作为一种体外培养系统，具有成本低、可重复性好、条件可控等优点。建立细胞系，不断增加和完善我国重要海水养殖动物细胞库，是长期保存重要海水养殖动物遗传资源的重要途径。同时，细胞系又是海水养殖动物细胞工程育种、动物克隆和物种保护、病毒分离与培养、研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等方面的重要工具。

尽管已经有多种鱼类及其不同组织建立细胞系的技术，但很多学者仍然认为建立细胞系是一项非常困难、繁琐、耗时、随机性大和成功率低的工作。不同鱼类之间的细胞系构建方法和难易程度往往不同。斑马鱼作为一种重要的脊椎动物模式生物，被广泛地应用于发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理与环保等方面的研究。针对斑马鱼的细胞系建立虽然已经做了很多研究，但是斑马鱼组织细胞系建立的研究仍有许多问题没有解决。目前已报道的斑马鱼细胞系仅有两个：ZF4(ATCC CRL-2050)和ZF-L(ATCC CRL-2643)，分别来自胚胎和肝脏。而同为鲤科的草鱼的细胞系建立相对容易，目前已报道了草鱼吻端、肾、肝、尾鳍、囊胚、椎骨间质、鳔等多个组织的细胞系。同时，鱼体不同的组织有着不同的特性，在细胞培养中的难易程度各不相同，有报道表明体表和肠道组织，消毒灭菌是培养的关键；肝脏组织因含有大量的油脂而难以培养；肌肉组织因细胞迁出及生长速度慢，不太适合建立细胞系(Zhou et al,J.fish biol.2008,73(8):2058-2067)。在原代培养的过程中，不同组织细胞迁出的速度有别，与鱼的种类有关，也与培养条件有关。事实上，每一株细胞系都是开展生物学等领域的研究的潜在资源。目前还没有统一和规范的建立鱼类细胞系的方法和技术手段。

迄今为止，已有160种以上的鱼类细胞系用于病毒的分离和扩增。已建立的鱼类细胞系多数来源于淡水鱼类，相比较而言，来源于海水鱼类的细胞系的报道较少。目前，仅有1篇报道建立了珍珠龙胆石斑鱼心脏组织细胞系(Guo et al.,2013)，还没有通过相应细胞系大规模生产病毒疫苗的成功报道。显然，鱼类细胞培养是进行鱼类病毒分离、鉴定与繁殖，进而研究鱼类病毒的致病机理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的最基础一步。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能稳定传代的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供研究平台和实验材料。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：