[发明专利]减毒沙门菌VNP20009在基因表达中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种减毒沙门菌VNP20009在基因表达中的应用，具体涉及一种以减毒沙门菌VNP20009为载体来传递效应基因的方法。

背景技术

沙门菌是一种侵袭性胞内菌，它与宿主之间的反应通过III型分泌机制介导，这种机制使细菌的效应蛋白能直接转移到真核细胞发挥作用，使其可以传递表达效应基因并同时表达多种治疗性蛋白。巨噬细胞是沙门菌的天然靶点，不仅在局部形成沙门菌的细胞靶点，而且建立细胞储存库使细菌系统性扩散。沙门菌侵入淋巴系统，通过血液循环定居在脾脏和肝脏等器官。

VNP20009是一种将野生型鼠沙门菌通过基因修饰构建的基因工程沙门菌，部分删除了编码脂质体A的末端序列msbB（明显减低诱导血液中单核细胞产生TNF-α的能力），并敲除purI基因（由于pur系列基因编码嘌呤合成途径中的一系列酶，purI基因缺失将影响嘌呤合成，进而影响DNA的合成从而使细菌毒性降低），两种突变使细菌毒力降低10000倍，同时没有影响沙门菌的肿瘤正常组织比（>1000：1），并保持了它们在原发灶及转移灶内生长能力。

    目前蛋白表达主要采用原核表达和真核表达系统，但有些蛋白却不易表达，本研究采用以减毒沙门菌VNP20009为载体，自行构建表达减毒沙门体系来有效地传递多种效应基因，避免了蛋白不易表达和主要表达在包涵体的缺陷。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种种减毒沙门菌VNP20009在基因表达中的应用，具体为以减毒沙门菌VNP20009为载体来传递效应基因的方法。

本发明所述应用包括下列步骤：

1、沙门氏菌感受态制备：挑取沙门氏菌VNP20009单菌落接种至3 mL无抗性LB培养中，37°C 200 rpm摇床培养过夜(约16 h)，次日将400 uL活化菌液加到40 mL无抗性LB液体培养基中，37°C 200 rpm摇床培养100 min至OD 600到达0．4左右将培养物冰上放置0．5 h，同时离心机预冷，5000 rpm离心5 min弃上清，沉淀用10％甘油10 mL悬浮细胞，冰上放置10 min重复离心，上述步骤再重复一次，最后一次离心的沉淀用400 uL 10％甘油重新悬浮细胞，感受态置冰上备用；

2、疫苗菌株构建：用电转化法将C20重组质粒分别导入感受态沙门氏菌VNP20009中，电转化条件：电压2.5kv、电容25 u F、电阻200 Q；

3、细胞侵染实验： HepG2.2.15细胞以1×1 0⁵细胞／孔的密度接种于96孔板，用无抗性培养基培养过夜，重组质粒细菌接种于1 00 ng／mL Amp抗性的LB培养基中，37℃恒温摇床200 rpm振荡培养过夜，至对数生氏晚期(OD600>3)，PBS清洗后用含有10％FBS的无抗性1640细胞培养基重悬；5×10 ⁷菌落形成单位的重组疫苗细菌加入细胞培养板内感染HepG2.2.15细胞，并且以空载体细菌作为对照，细菌与细胞共孵育3 h后，去除细胞培养上清，并用PBS清洗三遍，添加双抗(100 U／mL氨苄青霉素和100 U／mL硫酸链霉素)去除没有进入细胞内的细菌，培养1-2天后，检测细胞分泌乙肝表面抗原的量。

4、Elisa法检测乙型肝炎病毒表面抗原：

(1)加样：根据检验要求，将选择的预包被板条固定于板架，加入25ul样品稀释于板架，加入25ul样品稀释液于反应孔中。每次检验设阴性对照3孔、阳性对照2孔，加阴性、阳性对照各75ul；设空白对照1孔，不加样品，其余孔加入待测样品75ul，振荡混匀。

(2)温育：置37±1°C温浴60分钟。

(3)加酶：空白对照孔不加酶标记物，其余孔加入酶标记物50ul，振荡混匀。

(4)温育：置37±1°C温育30分钟

(5)洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30-60秒，弃去孔内洗液。重复洗6次后拍干。

(6)显色：每孔加入底物缓冲液50ul，再加入底物液50ul，振荡混匀，置37±1°C温育30分钟。

(7)终止：每孔加入终止液50ul，轻拍混匀。

(8)读值：用酶标仪读值，在单波长450nm（须以空白对照孔校零）或双波长450nm/620nm-700nm下读取各孔A值。