[发明专利]雷蒙德氏棉功能着丝粒序列及其分子标记

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息学与分子细胞遗传学领域，具体涉及雷蒙德氏棉功能着丝粒序列及其分子标记。

背景技术

着丝粒是高等真核生物染色体上重要的功能元件。在细胞有丝分裂和减数分裂过程中负责染色体的均等分离，从而起到确保遗传物质稳定传递的重要作用。由于着丝粒区域富含重复序列，难以进行测序组装，因此，其研究相对落后。例如，尽管人、果蝇和拟南芥等模式生物的全基因组测序早已完成，但其着丝粒因含有大量重复序列，往往仍然以不同长度的gap存在于基因组测序图谱上，无法被解析。因此，着丝粒的研究无论对于其生物学特性的揭示，还是基因组测序等研究领域都有着重要意义。

随着着丝粒研究的深入，人们发现，与广义的着丝粒即染色体上主缢痕的定义不同，着丝粒行使功能的区域普遍存在着一种特异组蛋白H3，即CENH3，因此，科研工作者将真正意义上的着丝粒定义为与着丝粒特异组蛋白结合的染色质区域，即功能着丝粒区。与此同时，由于CENH3在着丝粒定义中的重要意义，它已经被作为识别着丝粒功能区域和功能着丝粒DNA序列发掘的特殊标记。染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是研究生物体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法，因此，这一方法也成为功能着丝粒序列发掘的有效手段。该方法与第二代高通量测序技术相结合（ChIP-Seq）可以在全基因组水平高效地分 离、分析功能着丝粒DNA序列，目前已被广泛应用于功能着丝粒的研究中。

近年来，棉花基因组研究发展迅速，然而，棉花着丝粒的研究鲜有报道，而且仅有的报道基本上是以随机的DNA序列分析、筛选为主，无法确定DNA序列是否与CENH3结合，故其作为功能着丝粒序列的真实性有待商榷。本发明利用CENH3抗体进行ChIP-Seq实验，分析得到了四条雷蒙德氏棉功能着丝粒序列，其与CENH3绑定关系明确，并且通过FISH实验的进一步验证，明确了这些序列的着丝粒定位及其功能着丝粒序列的特性。同时，为了方便应用，我们根据其序列开发了相应地特异引物，为其克隆及应用提供了有力的工具。

发明内容

本发明的目的是发掘雷蒙德氏棉功能着丝粒序列，并开发其相应的分子标记，有利于棉花遗传图谱和物理图谱的构建，还有利于着丝粒形成与功能行使机制的探讨，也能够为棉花人工染色体的构建提供必需的序列信息。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

雷蒙德氏棉功能着丝粒序列，所述序列根据ChIP-Seq数据分析得到，名称分别为：序列1-Cluster201Contig81、序列2-Cluster285Contig8、序列3-Cluster291Contig8、序列4-Cluster407Contig2，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1-4所示。

所述的序列1-Cluster201Contig81、序列2-Cluster285Contig8、序列3-Cluster291Contig8和序列4-Cluster407Contig2相应的分子标记引物序列如SEQ ID NO.5-12所示。

表1雷蒙德氏棉功能着丝粒序列相应的分子标记

1、雷蒙德氏棉功能着丝粒序列

本发明的雷蒙德氏棉功能着丝粒序列是利用ChIP-Seq数据分析得到的。首先利用自行设计且可用的CENH3抗体特异性地富集CENH3-DNA复合体，然后纯化DNA片段，并经末端修复、加A和加测序接头后，再经低循环数的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳回收特定大小片段，完成测序文库制备的工作。利用Illumina Hiseq-2500测序仪进行测序，并通过生物信息学分析，鉴定出CENH3与基因组DNA结合的位点，并且明确与CENH3紧密结合的DNA序列。

2、引物的设计及其PCR扩增

本发明雷蒙德氏棉功能着丝粒序列在设计引物时，有以下注意事项：一是引物应用核酸序列保守内设计并具有特异性；二是引物长度一般为16-25 bp；三是引物序列的GC含量一般为40-60%；四是引物序列的碱基随机分布；五是PCR产物大小为200-700 bp。

PCR扩增的条件为：95℃预变性3min，95℃ 30s，47-53℃ 30s，72℃ 45s，35个循环，72℃总延伸7min。需要注意的是，引物序列不同，退火温度有所区别：序列1为50℃、序列2为47℃、序列3为53℃、序列4为51℃。PCR扩增的条带单一且明亮，故直接采用QIAGEN试剂盒进行PCR产物纯化回收，其货号：28104，名称：QIAquick PCR Purification Kit(50)。