[发明专利]槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的制备方法及其脂质调节方面的用途

说明书

技术领域：

本发明涉及生物药物领域，具体涉及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷及其制备方法，本发明还公开了其脂质调节方面的用途。

背景技术：

高血脂症(hyperlipidemia)是以血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)与低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)过高或高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平过低为症状的一种疾病。随着生活水平的不断提高，人们在日常生活中摄入糖脂过多，饮食结构改变的同时缺乏足够的运动，高血脂症的发病率逐年升高。近年来，由高血脂症诱发的动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死、高血压等心脑血管疾病发病率高达8％，严重危害着人类的健康。高血脂的预防和早期控制是防治心脑血管疾病发生的重要手段。而目前用于高血脂治疗的药物多为化学合成，不仅价格昂贵而且副作用较多，因此寻找天然的脂质调节药物意义重大。

槲皮素是一类含多个酚羟基的生物类黄酮化合物，具有抗氧化、抗炎、降低血压、保护心肌缺血等多种生物活性作用。另外大量研究表明，作为一种类黄酮物质其对脂质代谢也具有一定调节作用。然而槲皮素水溶性较低，生物利用度较差限制了其临床应用。

微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生化反应。微生物转化能专一地催化特定的反应并且具有高度的立体结构选择性；与化学催化相比，无需繁琐的保护与脱保护操作，具有高效、环保的优点，是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效方法。槲皮素结构上含有多个酚羟基，结构具有一定的可塑性，因此我们选用一种微生物对其进行结构修饰，特异性地催化3位羟基糖基化，以期解决其生物利用度差的问题，使其相应的药理活性能更好地临床上得到应用。

发明内容：

本发明公开了结构式I的化合物： 

命名为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。本发明同时也包括结构式I的化合物的溶剂化物。

表1 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷¹H-NMR和¹³C-NMR数据如下：

药理试验证明，本发明的结构式I化合物具有优异的脂质调节方面效果。

本发明的结构式I化合物优选用生物转化方法以槲皮素为底物进行转化制备，方法如下：

为了寻找适宜转化槲皮素成槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷的菌种，本发明共筛选了多个菌种，结果发现，保藏号为NRRL 1086菌种对槲皮素具有较强的转化能力(见表2)。

筛选所用液体培养基(PDA)：200g新鲜去皮马铃薯加沸水500ml煮15min后过滤，滤液 加葡萄糖20g、KH₂PO₄ 3.0g、MgSO₄ 0.75g、Vb₁ 10.0mg，加蒸馏水定容至1.0L，加NaOH或HCl调pH值至6.0，150ml三角烧瓶每瓶分装30ml液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌20min。

筛选菌种时，保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5％的琼脂，15ml具塞试管每管5ml，121℃、0.15MPa灭菌20min冷却后制成。

菌种的保存与活化：菌种活化采用两步活化法，先将菌种接种于液体培养基，28℃180r/min旋转培养24-48h后，转接于另一液体培养基，接种量1-5％(V/V)，同条件培养24h后加样。

样品的制备及加样：槲皮素溶于乙醇，配成10mg/ml溶液备用；每瓶经两步活化的菌液中(30ml)加1ml样品溶液，使每瓶菌液含槲皮素10mg。同条件培养24h后，终止反应，过滤菌体，发酵液用2倍量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏合并，加少许乙酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。

空白对照：空白对照设阳性对照(底物+培养基)、阴性对照(培养基+菌)、溶剂对照(培养基+菌+乙醇)，培养和萃取条件同上。

转化产物的薄层鉴定：

薄层条件如下：

薄层板：0.7％的CMC-Na制成的硅胶G板。

展开剂：氯仿∶甲醇∶甲酸(85∶15∶0.5)上行法展开。

显色剂：三氯化铁的乙醇溶液。