[发明专利]一种植物乳杆菌JLA‑9、及其生产的细菌素、细菌素的生产鉴定方法

权利要求书

1. 一种植物乳杆菌JLA-9，其特征在于：该菌种分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，已于2015 年4 月2 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10686。

2.一种细菌素，其特征在于：该细菌素氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

3.权利要求2所述的细菌素的生产方法，其特征在于包括下列步骤：

(1) 将保藏号为CGMCC NO.10686 的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9 按体积百分比1 ：100 接种于MRS 培养基中，37℃进行静止培养36h 后，得到含有细菌素的发酵液；

(2) 含细菌素发酵液经离心后收集上清液，用正丁醇萃取分离，将有机相进行真空浓缩，得细菌素粗提物；

(3) 细菌素粗提物经过Sephadex LH-20 和Sephadex G-25 分离收集活性馏分；

(4) 细菌素活性馏分通过HPLC 分离纯化细菌素。

4.权利要求3 所述的生产方法，其特征在于，细菌素发酵液的具体获得步骤如下：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9 接种于试管斜面MRS 琼脂培养基上，37℃培养24h，将菌种活化；然后将活化好的菌种接种于MRS 液体培养基，37℃、静止培养16 ～ 20h，至对数生长期，制成浓度为10⁷～ 10 ⁸cfu/ml 的种子液；将植物乳杆菌JLA-9 种子液以1％浓度接种于MRS 发酵培养基中，在37℃静止条件下培养36h，得到细菌素发酵液。

5.权利要求3 所述的生产方法，其特征在于，将细菌发酵素发酵液用正丁醇进行萃取分离，具体包括如下：发酵液在9000g 下离心30min 除去菌体，然后用与上清液3 倍体积的正丁醇以萃取法抽提两次后，将有机相经过真空浓缩，即为获得的细菌素粗提物。

6.权利要求5 所述的生产方法，其特征在于：细菌素粗提物进行分离纯化，包括如下步骤：

Sephadex LH-20 纯化：将正丁醇萃取得到的细菌素粗提取，经浓缩后上样SephadexLH-20 柱表面，打开恒流泵，调整好流速3ml/8min，采用体积比80％的色谱纯甲醇进行洗脱，利用自动收集器收集活性馏分，每9min 接1 管，洗脱3h，得到一个活性洗脱峰；同时，收集每管做抑菌实验，其中第35 管到第50 管收集的组分具有抑菌活性，其洗脱时间为495min-630min ；

(3)Sephadex G-25 纯化：将经过Sephadex LH-20 纯化得到的活性馏分经过真空离心浓缩仪在37℃条件下进行浓缩20 倍，之后，上样于Sephadex G-25，采用蒸馏水进行洗脱，流速控制3ml/8min，采用自动收集器收集活性馏分，每9min 接1 管，洗脱3h，得到一个活性洗脱峰；同时，收集每管做抑菌实验，其中第17 管到第25 管收集的组分具有抑菌活性，其洗脱时间为333min-405min ；

(4)HPLC 纯化：将经过Sephadex G-25 纯化得到的活性馏分在37℃条件下浓缩20 倍后，采用RP-C18 柱进行分离纯化，纯化条件：洗脱液为含0.1％质量的三氟乙酸的水和乙腈溶液；时间，50min，95％体积水+5％体积乙腈等浓度洗脱；流速为0.3ml/min ；检测波长为259nm ；细菌素HPLC 洗脱保留时间为20min。

7.根据权利要求6 所述的方法，其特征在于HPLC 纯化中高效液相色谱仪为美国AGILENT 1100series，配备DVD 检测器。

8.权利要求2 所述的细菌素的鉴定方法，其特征在于：将经过分离纯化后的细菌素利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定其分子量和鉴定其结构，其中，质谱分析采用MALDI-TOF-MS 分析，仪器为使用德国BRUKER 公司的Re Flex TM MALDI-TOF 质谱仪；质谱基质为α- 氰基-4- 羟基肉桂酸；质谱条件：波长355nm 的Nd YAG 激光器，加速电压20kV，激光强度4100，正离子谱检测，线性高分子模式。