[发明专利]一种抗链球菌溶血素“O”检测试剂盒及其制备

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗链球菌溶血素“O”(ASO)检测试剂盒及其制备。

背景技术：

链球菌溶血毒素“O”是溶血性链球菌的代谢产物之一，是一种含-SH基的蛋白质，能溶解红细胞，易被氧化，与空气接触可暂时失去溶血能力，形成-SS基但可借助还原剂使其恢复活力，重新具有溶血作用，溶血毒素“O”具有很强的抗原性。人受溶血链球菌感染后约85-90％的患者在感染后2-3周到病愈后数月或一年可查到链球菌溶毒素“O”抗体(简称抗“O”抗体)，若被检血清中有相应抗体，与溶血毒素“O”结合，不出现溶血，表示机体近期曾受过溶血性链球菌感染或反复受过溶血性链球菌侵害。故依据抗链球菌溶血毒素“O”抗体效价高低可辅助风湿热、急性肾小球肾炎等链球菌性变态反应疾病的诊断。

抗链球菌溶血素“O”的测定(即抗ASO)有溶血抑制法和胶乳法两种，溶血抑制法操作方法较繁琐，影响因素较多，因链球菌溶血素“O”的溶血作用易被胆固醇灭活，凡血清中胆固醇类含量增高者，其抗“O”均可出现假阳性，例如：饱食后取血、血清被细菌污染、血清中游离胆固醇升高、各种原发与继发性高胆固醇血症、各种溶血及炎症损伤的细胞膜胆固醇释放入血流等。胶乳法简便，影响因素少，溶血、脂血、高胆红素血症、高胆固醇血症，类风湿因子阳性以及标本被细菌轻度污染都不会影响试验的结果。所以此法已广泛使用。

胶乳法原理：被测血清中若有高滴度的ASO，在与ASO胶乳反应时会引起后者凝集，如预先用25结合单位/ml溶血素“O”中和后，不出现凝集者说明血清中ASO＜250单位，为阴性，仍出现凝集者说明血清中的ASO＞250单位，为阳性。

发明内容：

本发明的目的在于，大量制备ASO胶乳试剂，使用所获得的ASO胶乳试剂制备抗链球菌溶血素“O”检测试剂盒。

本发明的技术方案：应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使溶血素“O”与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，制备ASO胶乳试剂，利用获得的ASO胶乳试剂，制备抗链球菌溶血素“O”检测试剂盒。

本发明中，包括ASO胶乳试剂的制备及抗链球菌溶血素“O”检测试剂盒的制备。具体操作如下：

ASO胶乳试剂的制备：

1.相关缓冲液的准备

活化缓冲液：取800ml去离子水溶解9.76gN-吗啉乙磺酸(MES)，0.1％NaOH调PH至6.1，用去离子水定容至1L，15psi湿热灭菌20min。

标记缓冲液：取800ml去离子水溶解9.13g磷酸一氢钾和1.36g磷酸二氢钾，0.1％盐酸调PH至7.4，用去离子水定容至1L，15psi湿热灭菌20min。

保存缓冲液：800ml去离子水溶解9.13g磷酸一氢钾，1.36g磷酸二氢钾，1.0g Tween 20，0.1％盐酸调PH至7.4，用去离子水定容至1L，15psi湿热灭菌20min。

EDC活化缓冲液：取20mg EDC，溶于10ml活化缓冲液中，制成EDC活化缓冲液。

NHS活化缓冲液：取40mg NHS，溶于10ml活化缓冲液中，制成NHS活化缓冲液。

2.ASO胶乳试剂的配制

原料：羧化聚苯乙烯胶乳粒径为100-150nm，浓度为10％，取1ml，溶于3-7ml活化缓冲液中进行稀释。稀释好的微球溶液中加入1ml EDC活化缓冲液，1ml NHS活化缓冲液，室温20-25℃震荡10min，37℃恒温水浴20min。2-8℃离心(12000rpm，30min)，去除上清液，用标记缓冲液洗涤一次后，用标记缓冲液稀释至7ml。边搅拌边加入50mg溶血素“O”(市售)，用标记缓冲液补足至10ml，室温20-25℃震荡3hour，37℃恒温水浴3hour。离心(12000rpm，30min)，去除上清液，并用标记缓冲液缓冲液洗涤两次。洗涤后用保存缓冲液配成1％(重量体积比)悬液，以0.1％(重量体积比)叠氮钠溶液防腐，即为ASO胶乳试 剂。

抗链球菌溶血素“O”检测试剂盒的制备：

本检测试剂盒包括试剂R1与R2，具体成分如下：

以检测试剂盒R1：400ml，R2：100ml的规格为例进行配制。