[发明专利]一种抗肿瘤泛素化蛋白及其提取方法和应用

权利要求书

1.一种抗肿瘤泛素化蛋白，其特征在于，其主要是由以下步骤提取所得：

(1)肿瘤细胞的培养：复苏冻存的肿瘤细胞，按照常规培养方法培养；

(2)肿瘤细胞的处理：

按步骤(1)方法培养细胞待细胞生长至80％，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，加入量分别为(80-120)nmol/L、(160-240)nmol/L和(25-35)mmol/L，干预肿瘤细胞14-18小时，抑制泛素化蛋白的降解；

(3)提取泛素化蛋白：

将步骤(2)所得细胞经细胞裂解液处理后，离心得到沉淀，取上清液并同Vx3(A7)蛋白共孵育，经镍离子亲和层析可得到泛素化蛋白。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤泛素化蛋白，其特征在于，所述肿瘤细胞为多发性骨髓瘤细胞或黑色素瘤细胞。

3.根据权利要求1所述的抗肿瘤泛素化蛋白，其特征在于，所述步骤(1)中的常规培养方法如下：

复苏冻存的肿瘤细胞，40℃水浴融化后立即加入含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，重悬细胞至1×10⁶个/ml，并将其移入细胞培养瓶中，在37℃、5％(V/V)CO₂的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25％胰蛋白酶消化传代。

4.根据权利要求1所述的抗肿瘤泛素化蛋白，其特征在于，所述Vx3(A7)蛋白的提取方法包括如下步骤：

(1)将pUbiG101-Vx3(A7)-eGFP质粒转入大肠杆菌E.coli(DH5-α)；

(2)将步骤(1)得到的大肠杆菌挑取单克隆，LB培养基培养并做双酶切鉴定；

(3)将步骤(2)鉴定后的细菌扩大培养，于菌液600nm波长下吸光值为0.5时加IPTG诱导16h，高速离心8000rpm，15min，弃去上清；

(4)将步骤(3)高速离心后得到的沉淀用Bing buffer重悬，加入溶菌酶冰上反应30min；超声破碎后，高速离心12000rpm，10min，4℃；

(5)收集步骤(4)得到的上清，将其加入到镍离子亲和层析中，待与柱材料结合后，用Washing buffer洗去杂蛋白，用Elution buffer收集所要的Vx3(A7)蛋白，冻存于-20℃，备用。

5.权利要求1-4任一项所述抗肿瘤泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)肿瘤细胞的培养：复苏冻存的肿瘤细胞，按照常规培养方法培养；

(2)肿瘤细胞的处理：

按步骤(1)方法培养细胞待细胞生长至80％，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，加入量分别为(80-120)nmol/L、(160-240)nmol/L和(25-35)mmol/L，干预肿瘤细胞14-18小时，抑制泛素化蛋白的降解；

(3)提取泛素化蛋白：

将步骤(2)所得细胞经细胞裂解液处理后，离心得到沉淀，取上清液并同Vx3(A7)蛋白共孵育，经镍离子亲和层析可得到泛素化蛋白。

6.根据权利要求5所述的抗肿瘤泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为多发性骨髓瘤细胞或黑色素瘤细胞。

7.根据权利要求5所述的抗肿瘤泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中的常规培养方法如下：

复苏冻存的肿瘤细胞，40℃水浴融化后立即加入含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，重悬细胞至1×10⁶个/ml，并将其移入细胞培养瓶中，在37℃、5％(V/V)CO₂的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25％胰蛋白酶消化传代。