[发明专利]一种试剂盒及其应用、检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品领域，特别涉及一种试剂盒及其应用、检测方法。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌是一种具有周生鞭毛，能运动，无芽孢，兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，可引起婴幼儿死亡，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，报告病例的病死率达20％～50％，幸存者常有严重的神经系统后遗症。流行病学研究显示，受污染的婴儿配方奶粉是引发婴儿、早产儿感染阪崎克罗诺杆菌的主要渠道。

目前婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的检测方法主要通过培养法分离、鉴定，整个过程操作繁琐，耗时长，阳性率低。实时荧光PCR方法具有敏感性、特异性和稳定性特性，可很好的弥补上述不足，现已在婴儿配方奶粉生产企业广泛应用。但阪崎克罗诺杆菌在婴儿配方奶粉生产过程中经过巴氏杀菌后多数已经死亡，由于DNA在死菌中能保留很长时间，而传统的荧光定量PCR方法无法区别死菌和活菌，干扰了检测的真实性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种试剂盒及其应用、检测方法。本发明提供一种检测配方奶粉中活的阪崎克罗诺杆菌的EMA实时荧光PCR试剂盒及检测方法，实现了对婴儿配方奶粉中活的阪崎克罗诺杆菌快速、准确、特异检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种试剂盒，包括引物组；所述引物组包括具有如SEQ ID No.1所示的上游引物和具有如SEQ ID No.2所示的下游引物。

在本发明的一些具体实施方案中，试剂盒还包括荧光探针。

在本发明的一些具体实施方案中，试剂盒中所述荧光探针具有如5′-FAM-SEQ ID No.3-MGB-3′所示的序列。

在本发明的一些具体实施方案中，试剂盒还包括叠氮溴乙锭。

在本发明的一些具体实施方案中，试剂盒还包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶中的一种或两者以上的混合物。

本发明还提供了所述试剂盒在检测活的阪崎克罗诺杆菌中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒在检测活的阪崎克罗诺杆菌中的应用中所述活的阪崎克罗诺杆菌为婴儿配方奶粉中活的阪崎克罗诺杆菌。

本发明还提供了基于所述试剂盒的检测活的阪崎克罗诺杆菌的方法，取待测样品经预处理后，提取核酸，扩增，CT值小于30，检测结果为阳性。

在本发明的一些具体实施方案中，基于所述试剂盒的检测活的阪崎克罗诺杆菌的方法中所述活的阪崎克罗诺杆菌为婴儿配方奶粉中活的阪崎克罗诺杆菌。

在本发明的一些具体实施方案中，基于所述试剂盒的检测活的阪崎克罗诺杆菌的方法中所述预处理为所述待测样品经叠氮溴乙锭处理。

在本发明的一些具体实施方案中，基于所述试剂盒的检测活的阪崎克罗诺杆菌的方法中，总反应体系25μL，包括2×Premix Ex Taq ^TM 12.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.3μL，探针(20μmol/L)0.3μL，ROX 0.2μL，模板DNA各为5.0μL，用ddH₂O补足。

在本发明的一些具体实施方案中，基于所述试剂盒的检测活的阪崎克罗诺杆菌的方法中，反应条件为预变性95℃2min，变性95℃30s，退火60℃30s，40个循环。在60℃处设定荧光检测点。荧光检测模式选择FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线。

本发明采用的技术方案是：提供了婴儿配方奶粉中活的阪崎克罗诺杆菌的EMA实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、EMA试剂、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物:5′-gca caa gcg gtg gag cat-3′

下游引物:5′-aac cca aca ttt cac aac acg ag-3′

荧光探针：5′-FAM-ctt acc tgg tct tga cat c-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。

本发明关键在于样品EMA前处理，特异性引物和荧光探针序列的设计及检测方法，PCR试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作婴儿配方奶粉中活的阪崎克罗诺杆菌的定性检测，也可加入标准菌株标准品进行定量检测。