[发明专利]一种抗乙型肝炎病毒的脱氧核酶10-23及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种抗乙型肝炎病毒的脱氧核酶及其制备方法和应用。

背景技术

乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病，该病由一种嗜肝细胞的小包膜DNA 病毒——乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）引发，持续性病毒感染会导致肝脏损伤、肝硬化以及原发性肝细胞癌。全球约1/2的人生活在HBV 高流行区，众多HBV慢性感染者正面临着肝病所致的死亡风险，每年有数百万患者死于HBV相关的肝硬化和肝癌。

我国属于HBV高流行区，估计人群HBsAg阳性率约10％，即我国乙型肝炎病毒携带者接近1亿多人，慢性乙型肝炎现症患者超过3000万人，每年与HBV相关的肝硬化和肝癌死者达数十万。因此，HBV 感染已成为我国严重的公共卫生问题之一。

目前针对HBV感染的常规疗法大多依赖化学制剂或细胞因子等，但存在转阴率低、对人体毒性较大、易产生抗药性等当前乙肝治疗药物的普遍缺点。例如，干扰素a只对一小部分HBV感染者有疗效，而核苷类似物虽能通过抑制HBV复制发挥明显的抗HBV作用，但是可能诱发病毒变异及停药后反弹，从而无法达到令人满意的疗效。虽然许多国家已相继开发出针对HBV感染具有良好预防作用的乙肝疫苗，但对于已感染HBV的机体却难以发挥治疗和清除病毒的作用。因此，发展一种新型抗病毒药物已成为迫切需要。

近年来随着体外分子进化技术（SELEX）的发展，人们发现，除了RNA分子以外，某些序列独特的单链小分子DNA也具备酶的活性，称之为脱氧核酶（Deoxyribozyme, DRz）。它可通过碱基互补配对特异性结合并在特定位点裂解靶RNA 分子，同时又可能具有类似反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对靶RNA的反义抑制活性，因此在基因调控和抗病毒治疗方面的潜在应用价值受到人们的广泛关注。

脱氧核酶10-23（DRz10-23）是Santoro等从10¹⁴个随机序列中通过体外PCR 筛选法获得的第10轮循环的第23个克隆，并因之而得名。该酶活性中心由15个脱氧核糖核苷酸组成，其5′末端第8个碱基可以是T、C或A ,以T 活性最高，其余序列高度保守。脱氧核酶DRz活性中心两侧的碱基序列一般长7-9nts，必须与靶RNA碱基序列互补配对，从而保证DRz对靶RNA切割的特异性。

HBV基因组全长3.2kb，包括四个开放阅读框，分别编码核心抗原（C）、表面抗原（S）、聚合酶（P）以及X 蛋白。HBV各基因转录产物RNA同时为病毒复制和蛋白翻译所必需，且HBV基因组高度重叠，因此在RNA水平阻断HBV各蛋白的表达具有一举两得的优势。

脱氧核酶10-23的酶动力学研究表明，其催化效率比发夹型核酶及锤头型核酶的催化效率更高。由于脱氧核酶10-23在靶底物上识别的剪切位点为5′…R↓Y…3′(其中R = A/G，Y = U/C)，该位点在RNA分子中广泛存在，包括病毒RNA翻译起始密码子A/UG在内可能均是良好的剪切靶位，因此较Rz有更多的剪切位点可供选择。除此之外，化学性质相对稳定、分子量相对小、不易受核酸酶降解、在技术上易于制备且成本较低以及脱氧核酶与靶RNA 形成的DNA-RNA杂交分子较易解离等特点均成为脱氧核酶应用于基因治疗等方面的优势。

脱氧核酶10-23作为一种潜在的强有力的RNA特异性切割工具，无论是在体外应用于RNA限制性内切酶，还是在体内作为RNA水平上的基因失活剂，均具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于通过对乙型肝炎病毒S基因保守序列为靶点进行研究，提供一种靶向治疗乙型肝炎的脱氧核酶10-23及其在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种抗乙型肝炎病毒脱氧核酶10-23，其序列为5'-GTCCAGAAGAAGGCTAGCTACAACGACAACAAGAA-3'，其中G为鸟嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，A为腺嘌呤核苷酸单体；下划线所示为脱氧核酶10-23的催化核心序列。

核苷酸单体中的碱基为鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或腺嘌呤。

本发明同时提供脱氧核酶10-23在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。