[发明专利]一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工艺和食品加工领域，涉及一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法，具体涉及鹰嘴豆籽粒中贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法。

背景技术

碳水化合物、脂肪和蛋白质这三种营养元素为人体提供绝大部分的能量，其中碳水化合物提供的热量约占全部的60％-70％，如果碳水化合物摄入量过多就会转化成脂肪囤积在机体内，过多的摄入和剩余将会引发肥胖、高血糖、糖尿病等“富贵病”。

鹰嘴豆，其籽粒尖如鹰嘴，又叫桃豆、羊头豆、诺胡提等，在我国新疆已有2500多年的栽培历史。鹰嘴豆为维吾尔族常用药材，具有很高的药用价值，中医用于调湿止泻，解毒消炎，强骨健胃等，此外，通过大量临床经验证明鹰嘴豆对70多种严重营养不良有明显的疗效，因此鹰嘴豆成为开发对人类健康有益营养成分的重要植物材料。α-淀粉酶能将多聚糖淀粉水解为单糖葡萄糖，进而作为机体吸收的能量来源，在人们生活膳食中发挥着重要的作用。α-淀粉酶抑制剂能够有效地与人体口腔、胃肠道唾液α-淀粉酶及胰脏分泌的α-淀粉酶结合形成酶-抑制剂的复合物，使α-淀粉酶活性丧失或降低来阻碍食物中碳水化合物的水解和消化。基于α-淀粉酶抑制剂自身的特点，α-淀粉酶抑制剂在医学和农业生产中有广泛的应用前景，一方面α-淀粉酶抑制剂可以作为防治和治疗高血糖、糖尿病及高血脂等疾病的药物，另一方面也可以应用于日常生活中保健，控制饮食，减少肥胖；同时α-淀粉酶抑制剂基因及产物对农业昆虫防治和减少杀虫剂使用、保护生态环境有重要的应用价值。

我们前期对鹰嘴豆种子α-淀粉酶抑制剂粗提液经硫酸铵分级沉淀、离子交换色谱和反相色谱的分离纯化后获得一个具有抑制α-淀粉酶活性的蛋白，它属于贮藏蛋白类型(其在NCBI中编号为Q9SMJ4)，受Q9SMJ4基因控制，完全不同于已知的α-淀粉酶抑制剂类型，是一种新的类型。该蛋白由alpha亚基(或蛋白链)和beta亚基(或蛋白链)2个亚基组成，为蛋白前体，其在生物体内最终将剪切生成alpha链和beta链。alpha肽链和beta肽链蛋白空间结构中各含有一个Cupin结构(如图1)。我们进一步研究发现凡具有Cupin结构(功能域)的蛋白普遍具有α-淀粉酶抑制活性，Cupin结构为关键的功能域。由于鹰嘴豆籽粒中该贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂含量很少，采用天然鹰嘴豆籽粒材料进行提取纯化，过程复杂，成本昂贵，不适于此类蛋白的提取分离和开发利用。采用生物技术，运用合理的生物工艺流程可为鹰嘴豆中α-淀粉酶抑制剂的生产及纯化提供新途径。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法，包括以下步骤(1)和选自步骤(2)和步骤(3)中的一项或两项：

(1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达：

将目的蛋白的ORF克隆至原核表达载体，并构建Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系；培养Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系，并诱导目的蛋白表达；其中所述的原核表达载体含有His标签蛋白编码基因；

(2)原核表达可溶性蛋白纯化：

a.每50mL培养菌液收集的菌体用10mL缓冲液1重悬菌体，，并加入150～200μL 35％的TritonX-100和50～100μL 100mM的PMSF；

b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体；

c.将超声破碎过的菌液离心，收集上清，弃沉淀；

d.将含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0.5-1.0mL/min，直至上清液完全流过Ni柱；

e.用6～10倍柱体积的缓冲液2冲洗Ni柱或直至A₂₈₀值达到稳定；

f.洗脱His标签表达蛋白采用梯度洗脱方式，每一梯度洗脱体积为4～5个柱体积，收集各个梯度洗脱蛋白；

g.通过SDS-PAGE电泳检测上一步中各洗脱梯度洗脱蛋白纯度，确定适合收集的洗脱组分；

h.将收集的洗脱蛋白液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透析20～24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；

i.将透析结束的透析袋放入40％(w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即为原核表达并纯化收集的目的可溶性蛋白溶液；

(3)原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性：