[发明专利]一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方法。

背景技术

产毒多杀性巴氏杆菌(Toxigenic pasteurellamultocida，T⁺Pm)是猪传染性萎缩性鼻炎(Atrophicrhinitis，AR)的主要病原菌。猪萎缩性鼻炎能造成猪只鼻甲骨萎缩，破坏了鼻粘膜免疫屏障，进而继发其他呼吸道疾病，造成养猪业的重大经济损失。研究表明产毒多杀性巴氏杆菌可引起进行性萎缩性鼻炎，其中以产毒多杀性巴氏杆菌毒素为主要的致病因子。多杀性巴氏杆菌按荚膜分为A、B、D、E、F等6个血清型，有报道表明，T⁺Pm以D型产毒为主,也有A型产毒，而T⁺Pm主要分离于AR严重的猪。

目前防治猪萎缩性鼻炎主要是通过疫苗免疫，在猪萎缩性鼻炎灭活疫苗生产过程中，产毒多杀性巴氏杆菌主要是采用甲醛溶液灭活，菌株灭活效果的好坏直接影响到疫苗的安全性和免疫效果。目前，检测产毒多杀性巴氏杆菌菌液灭活效果，主要检测菌株是否能灭活，而忽略产毒多杀性巴氏杆菌毒素是否灭活。据文献报道产毒多杀性巴氏杆菌毒素检验是通过豚鼠皮肤坏死试验检测，所以有人采用皮肤坏死试验来测定产毒多杀性巴氏杆菌毒素是否灭活。由于菌株培养时间不同、豚鼠个体差异及人员操作误差可引起假阴性，同时豚鼠皮肤坏死试验是用灭活后的菌液，菌体占的比例较小，无法合理反应出菌体内产毒多杀性巴氏杆菌毒素是否灭活。目前，可通过超声裂解的方式获得粗提产毒多杀性巴氏杆菌毒素，少量的粗提产毒多杀性巴氏杆菌毒素就可对Vero单层细胞产生典型的病变。产毒多杀性巴氏杆菌毒素的毒力强，对小鼠的LD₅₀仅为0.2ug。

发明内容

本发明的目的在于：采用Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果，该方法能较传统的通过豚鼠皮肤坏死检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果方法更加灵敏，能直接反应出毒素的灭活效果，从而降低产毒多杀性巴氏杆菌制备的疫苗副反应，提高疫苗的安全性。

本发明的技术方案：一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方法，包括：步骤1：将产毒多杀性巴氏杆菌接种于脑心浸液培养基，置于36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min培养12～18小时，收获菌液；

步骤2：将甲醛溶液按照0.3％的终浓度(v/v)加入步骤1中制备好的菌液中，置36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min作用48小时后，灭活菌液备用；

步骤3：取步骤2中制备好的灭活菌液在4℃条件下，以10000r/min离心30分钟，聚集菌体，用与灭活菌液同体积的无菌PBS漂洗4次后，用灭活菌液1/5体积的无菌PBS悬浮，将灭活菌悬液转移至离心管，将离心管置冰水混合物中放入超声波仪器内室，40％输出功率，每工作4秒，间隔15秒，超声破碎30分钟；在4℃条件下，以10000r/min离心30分钟收集上清菌毒素液，上清菌毒素液经0.22滤膜过滤，无菌检验合格后，备用；

步骤4：将培养好的单层Vero细胞消化计数后，用含2％胎牛血清MEM培养基将细胞悬液稀释至2×10⁵个/ml，向多孔实验孔板中每孔加100μl MEM培养基；将步骤3制备好的上清菌毒素液，按照等倍稀释的方法依次加入实验孔板的孔中；然后，每孔再加入100μl稀释好的Vero细胞悬液，混匀后置36～38℃，CO₂培养箱培养七天后观察结果；细胞拉丝病变判为阳性，细菌聚团判为可疑，无病变判为阴性。产毒多杀性巴氏杆菌包括A型产毒多杀性巴氏杆菌和D型产毒多杀性巴氏杆菌。

本发明的有益效果：利用本方法能更准确的检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素是否完全灭活或者最大限度的灭活，从而很好的保证了相关疫苗的安全。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图1为粗提产毒多杀性巴氏杆菌毒素液致Vero细胞病理变化；

附图2为不同甲醛浓度，灭活不同时间灭活菌液制备疫苗免疫试验猪鼻甲骨病理变化。

具体实施方式

菌液的制备：将产毒多杀性巴氏杆菌接种于脑心浸液培养基，置于36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min培养12～18小时，收获菌液。