[发明专利]诱导型启动子的调控

说明书

本申请是申请日为2011年7月27日、发明名称为“诱导型启动子的调控”的中国发明专利申请No.201180036765.5的分案申请。

本发明涉及异源多肽在重组细菌宿主细胞中的生产。具体地，本发明涉及通过使用特定底物(诱导物)可诱导的启动子而调节编码多肽的异源核酸序列的表达。最具体地，本发明涉及异源多肽在细菌宿主细胞中的表达的调控，其中已使得细菌宿主细胞不能在诱导物不存在的情况下失活控制异源多肽表达的启动子。

发明背景

异源多肽在重组微生物中的产生的一个重要方面是选择用于控制编码靶多肽的异源核酸序列的表达的启动子。

适当的启动子应当比较强。即，以高速率产生相应mRNA，从而允许以较高的量产生多肽。此外，启动子应当容易受到调控并且仅在诱导时开始异源多肽的产生。

然而，存在通常诱导底物为微生物的营养物并且被微生物消耗的问题。然而，当用于培养微生物的培养基耗尽诱导底物时，微生物使启动子失活，从而靶多肽的表达停止。为了避免基因表达的不希望的停止，必须以较高的量添加和/或连续补充诱导物。较高量的诱导物的需要增加了发酵工艺的成本。此外，需要昂贵诱导物的高效启动子的使用也受到限制。

因此，为了生产重组多肽，需要其中控制异源多肽表达的启动子的活性不依赖于诱导物的存在、但异源多肽的表达仍然可被严密调控的宿主细胞。

WO2006/133210A2涉及在利用甘露醇、阿糖醇、葡糖醇或甘油-诱导型启动子的细菌宿主细胞中生产重组多肽的方法，其中已使得细菌宿主细胞不能降解或代谢诱导物。根据所述方法，对基因组中编码代谢所述诱导物所需的酶的一个或多个基因进行了遗传改变或缺失，以便细胞不能从其基因组表达代谢或降解所述诱导物所必需的功能性酶。为了确保诱导物的摄入，不影响与诱导物转运至细胞内相关的基因。

然而，该方法需要另外添加用于催化控制靶多肽表达的相应启动子的激活的诱导物。

此外，诱导物在细胞中的积累可不利地影响细胞的发育。

许多细菌能够利用不同的碳源。如果提供以碳源的混合物，则选择允许最快速生长的碳源(主要碳源)。同时牵涉次级碳源的利用的功能被称为碳分解代谢物阻遏(CCR)的现象抑制。

除了CCR外，参与较不优选的次级碳源的利用的特定分解代谢基因仅在所述次级碳源存在的情况下表达。因此，参与次级碳源的分解代谢的基因的表达依赖于所述次级碳源的存在(诱导)以及主要碳源(分解代谢抑制)的不存在。

TianquiSun等人的出版物“Characterizationofamannoseutilizationsysteminbacillussubtilis“,JournalofBacteriology,AmericanSocietyforMicrobiology,第192卷,第8期,2010年4月1日，第2128页至2139页涉及甘露糖操纵子及其基因以及受甘露糖调节的启动子PmanP和PmanR的鉴定。据报导，甘露糖的代谢受控于磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统，并且甘露糖操纵子还受控于碳分解代谢物阻抑。为了表征和鉴定单个基因的功能，制备缺乏相应基因、从而不存在由所述基因编码的相应蛋白质的敲除突变体。已发现甘露糖转运蛋白基因manP的缺失导致从启动子PmanP和PmanR的组成型表达，这表明甘露糖转运蛋白ManP对甘露糖操纵子和编码甘露糖特异性转录调节剂ManR的manR基因的调控具有负作用。

Tobisch等人“RegulationofthelicoperonofBacillussubtilisandcharacterizationofpotentialphosphorylationsitesoftheLiRregulatorproteinbysite-directedmutangenesis”，JournalofBacteriology,第181卷,第16期,1999年8月19日，第4995-5003页报导了：调节剂LicR的EIIA结构域中的磷酰基结合氨基酸替换为另一个氨基酸导致了诱导底物不存在的情况下突变调节蛋白LicR的活性。