[发明专利]一种从禽肉中提取哌嗪残留的方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种禽肉中哌嗪残留的提取和净化的方法。

背景技术

在对动物源性食品中的兽药进行检测时，只有将药物从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。哌嗪为白色叶片状结晶，弱碱性，在空气中吸收H₂O和CO₂，易溶于水，微溶于乙醇。国内外关于哌嗪的提取方法有一些报道，提取剂一般为甲醇、乙腈、三氯乙酸溶液和高氯酸溶液等。目前，国内外对猪组织、鸡蛋、牛组织及蜂蜜中哌嗪提取和净化的方法均有报道，以1％氨水乙腈为提取剂，乙腈饱和正己烷去除脂肪以达到净化的效果，但该方法在本发明建立的色谱条件下所得色谱峰峰形较差，有严重拖尾现象，且提取回收率低于60％，不能满足哌嗪在禽肉中残留检测的要求。

发明内容

为了解决现有技术不能从禽肉中提取哌嗪残留的问题，本试验建立了一种提取和净化的方法，该方法简单、方便、快速，有机试剂用量少，提取回收率高。

本发明的技术方案是：一种从禽肉中提取哌嗪残留的方法，是以5.0％三氯乙酸水溶液和乙腈的混合溶液为提取剂处理禽肉样品得提取液，提取液中加入乙腈饱和的正己烷去除脂肪后，用固相萃取法净化，再通过UPLC-MS/MS测定分析。

具体地，将禽肉样品均质后，加入5.0％三氯乙酸水溶液和乙腈混合溶液(体积比3:1)振荡、混匀直接提取，离心，将上清液转移。重复提取1-2次，合并上清液，即得提取液。

向提取液中加入乙腈饱和的正己烷去除脂肪后，过混合阳离子固相萃取小柱(Strata-X-C)，先依次用甲醇、超纯水、2.0％甲酸水溶液将SPE小柱活化平衡，上样后待提取液匀速流干后，再依次用2.0％甲酸水溶液、超纯水、甲醇淋洗，待小柱干燥后，最终用10.0％氨水乙腈进行洗脱。最后洗脱液用氮气吹干，上机前用2.0mL 20.0％甲醇水溶液涡旋振荡溶解残渣，转移2.0mL复溶液至离心管中，常温离心10min，将上层清液过0.22μm滤膜，滤液供UPLC-MS/MS和HPLC-MS/MS测定分析。

与现有的技术相比，本发明采用5.0％三氯乙酸水溶液和乙腈混合溶液为提取剂(体积比3:1)，固相萃取法净化，所得色谱峰峰形较好，且回收率达85.33％以上。乙腈和三氯乙酸可以有效地去除蛋白质，并将药物高效地提取出来，固相萃取法能减少内源性杂质的污染，样品净化效果较好，明显优于传统技术。

有益效果：本发明比较了不同提取剂(甲醇、乙腈、氨水乙腈和三氯乙酸)、不同净化方法(液液萃取法和固相萃取法)对提取回收率的影响，最终选择5.0％三氯乙酸水溶液和乙腈混合溶液为提取剂(体积比3:1)为提取剂，固相萃取法为净化方法，哌嗪的提取回收率均达到90％以上。不同提取试剂、提取方法对鸡肌肉中哌嗪提取回收率的影响见表1。

表1 不同提取试剂、提取方法对鸡肌肉中哌嗪提取回收率的影响(％)

具体实施方式

1.实验家禽的饲养和样品采集

分别选取销往各活禽农贸市场和超市的上市日龄肉用家禽，即16周龄京海黄鸡、10周龄扬州鹅和8周龄樱桃谷鸭各12羽，公、母各半，单笼饲养，饲喂不含任何药物的全价饲料，自由饮水。饲养2周后屠宰时分别取两侧胸肌作为空白家禽肌肉样品，-35℃保存，使用时将该样品绞碎使之均质。

2.本发明提取与净化步骤

1)用粉碎机将禽肉均质；

2)准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白家禽肌肉样品，置于50.0mL聚丙烯带盖离心管内；

3)加入6.0mL 5.0％三氯乙酸水溶液和2.0mL乙腈，涡旋混匀2min，水浴超声振荡辅助萃取10min；

4)以12000×g，4℃离心10min，将上清液转移至另一50.0mL离心管中；

5)重复提取(6.0mL 5.0％三氯乙酸水溶液和2.0mL乙腈再次提取沉淀物，涡旋振荡2min，超声振荡辅助萃取10min)，12000×g，4℃离心10min，合并两次上清液；

6)向上清液中添加10.0mL乙腈饱和的正己烷，涡旋振荡3min，6000×g，4℃离心5min，弃去上层正己烷，重复去脂一次，最终得到提取液；

7)依次分别用3.0mL甲醇、3.0mL超纯水、3.0mL 2.0％甲酸水溶液将混合阳离子固相萃取小柱(Strata-X-C)活化；