[发明专利]一种高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法。

背景技术

以C18为代表的高效反相液相色谱柱一直被描述为药物发现、开发、方法验证(validation)的心脏，高效反相液相色谱柱也极其广泛地应用在药物代谢及动力学、生命科学、医疗健康、生物分析检测、毒品和兴奋剂检测、食品安全分析、环境分析、军事、国土安全等领域。高效反相液相色谱制备柱也是最重要的分离纯化技术之一。

常规HPLC方法的开发几乎总是从C18作为出发点，反相色谱占了80％以上的应用。无论是过去、现在还是可预见的未来，以球形B型硅胶为材料骨架的高效反相液相色谱柱在实际应用中一直占有统治地位。

过去数十年来，无数努力集注于改善硅胶的品质、优化键合化学和封端技术。

二十多年前，使用有机硅材料取代无机硅材料作为起始原料生产球形硅胶代表一个划时代的革命，生产的球形硅胶命名为B型球形硅胶。无机A型硅胶重金属含量很高，硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等导致许多碱性化合物回收率低。球形B型硅胶重金属含量很低，在非常大的程度上消除了A型无机硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等问题。用B型球形硅胶合成高效液相色谱填料，导致高效液相色谱柱产品质量有质的飞跃。

十多年前，Waters公司首先引入市场的超高压超高效UPLC技术，使用小于2μmB型球形硅胶生产的UPLC超高效液相色谱柱，和Advanced Material公司首先引入市场的1.7μm和2.6μm核壳硅胶型球形硅胶生产的UHPLC超高效液相色谱柱代表另一个划时代的革命。UPLC，UHPLC超高效液相色谱柱柱效是传统5μm的高效反相液相色谱柱的三至四倍，因此使用短的5cm长度UPLC,UHPLC超高效液相色谱柱经常可以到达同5μm25cm长度的高效液相色谱柱同样的效果，但分析时间缩短三至四倍，大大提高了分析速度。

在键合化学上，过去数十年来除了优化传统的C18、C8、Phenyl键合化学外，最重要的是Supelco公司首先引入市场的极性嵌入式(Polar embedded)键合相。极性嵌入式(Polar embedded)键合相是C18高效反相液相色谱卫星群中最重要的产品，是C18和C8键合相最重要的补充。极性嵌入式(Polar embedded)键合相起源于Supelco ABZ。Supelco ABZ的键合方法是用aminopropyl键合相和长链羧酸缩合反应形成一个C16酰胺。这个键合相对碱性化合物具有比较好的峰形，但很明显是以牺牲酸性化合物和两性化合物峰形为代价，因为aminopropyl键合相的NH₂功能团不可能完全反应，键合相在酸性pH值下表面电荷为正。需要说明的是，市场上一些C18就是使用携带正电荷的键合或封端试剂生产的。从ABZ起头，Supelco充分认识到上述战略的副作用，因此首先使用氨丙基硅烷合成C16酰胺硅烷，然后键合到B型球形硅胶上，这就是Supelco著名的Amide。由于没有专利保护，其他色谱厂商踊跃模仿，最终形成以酰胺或酰酯作为代表的极性嵌入式(Polar embedded)键合相群。极性嵌入式(Polar embedded)键合相的选择性独特，一些在C18和C8键合相上困难的分离可能在极性嵌入式(Polar embedded)键合相上得到很好的解决。在相同条件下，合格的酰胺极性嵌入式键合相比相应的C18键合相对碱性化合物有更好的峰形，因为酰胺和碱性化合物有极性-极性(电荷转移)的相互作用，客观上部分屏蔽了酸性硅醇基效应。合格的酰胺极性嵌入式键合相能够在100％水相条件下使用，而且比所谓的水相C18稳定得多。

尽管取得了这些进展，键合相封端问题没有获得很好的解决，一直是困扰色谱领域最大的问题。迄今为止全部的尝试只获得有限的成功，键合相封端几乎全部使用固-液回流。事实上，不管什么样的催化剂和封端试剂被使用，固-液回流下的封端是一个死胡同。用同一厂商同一工艺生产的不同孔径和不同粒径的B型球形硅胶，用同一键合化学生产的C18键合相最能够体现这一点。一般来说，大孔硅胶C18键合相酸性硅醇基效应(例如C18)明显小于相应的中孔硅胶C18键合相，中孔硅胶C18键合相酸性硅醇基效应明显小于相应的小孔硅胶C18键合相。此外，一般来说，同一孔径B型球形硅胶，用同一键合化学生产的C18键合相，10μm粒径键合相酸性硅醇基效应明显小于5μm粒径键合相。5μm粒径键合相又明显小于3μm粒径键合相，3μm粒径键合相粒径键合相又明显小于1.7μm粒径键合相。

发明内容