[发明专利]一种人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒

说明书

技术领域

本申请涉及一种人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒。

背景技术

早在1966年，Hopsu-Havu和Glenner等在鼠的肝、肾组织中发现了一种新的二肽氨基肽酶。这种酶能水解甘氨酰-脯氨酰-B-萘胺，释放二肽甘氨酰脯氨酸，而被称为甘氨酰脯氨酸-B-萘胺酸。由于甘氨酰脯氨酰-B-萘胺有致癌作用，Nagatsu等合成了新底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺，并为大家广泛接受，这种酶也一度被称为甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺酶，现已通称为甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycyl proline dipeptidyl aminopeptidase,GPDA)。

临床上，血清GPDA明显降低可作为胃癌的诊断指标，一般在正常人的1/2左右，其他良性胃肠道病变GPDA也可略有下降，胃癌切除后，病人血清GPDA有回升趋势。各类肝病血清GPDA也有不同程度的增高，升高幅度不及肝癌患者。尿液GPDA增高是肾小管早期损伤的诊断指标。

GPDA测定试剂中的主原料-甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸(GPN)，配制成液体试剂后极不稳定，易水解变质，只能当天使用，否则必须在零摄氏度下冰冻保存，临用前复融混匀，一次使用，不能反复冻融，给实际应用带来很大不便，也易影响测定结果的准确性。

发明内容

本申请的目的是提供一种人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris-双甘肽缓冲液、底物稳定剂；所述试剂II含有甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸、底物稳定剂。

进一步的，所述试剂I中Tris-双甘肽缓冲液为100-300mmol/L，底物稳定剂的浓度为0.01-0.15g/mL。

进一步的，所述试剂I中Tris-双甘肽缓冲液为150mmol/L，底物稳定剂的浓度为0.06g/mL。

进一步的，所述试剂II中甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸含量为100-300mmol/L，底物稳定剂含量为0.01-0.15g/mL。

进一步的，所述试剂II中甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸含量为150mmol/L，底物稳定剂含量为0.06g/mL。

进一步的，所述Tris-双甘肽缓冲液PH为8.6。

进一步的，所述底物稳定剂为NaN₃。

本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂盒，其中装有上述定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。

本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37℃孵育5分钟，然后向样品中加入试剂II，37℃延迟1分钟，在405nm或410nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值△A_样本/min；用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A_空白/min；再通过下式(1)计算得到血清样品的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性：

GPDA活性(U/L)＝(△A_样本/min-△A_空白/min)×K  (1)

主波长405nm：K＝1955

主波长410nm：K＝2259

本方法的原理为：在碱性条件下，GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者可引起在特定波长下吸光度的升高，吸光度升高速率与GPDA活性成正比。

本发明直接定量测定人血清样品中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂盒，是将分别放置的上述试剂I和试剂II以不同的规格装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格，可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。

本发明采用的试剂盒及检测方法只需十几微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。

具体实施方式

实施例一

按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：

试剂I:

Tris-双甘肽缓冲液  100mmol/L