[发明专利]一种对克罗诺杆菌O抗原特异的核苷酸及其应用

说明书

本发明申请是申请号：201410150358.2，申请日：2014.04.16，发明名称：一种对克罗诺杆菌O抗原特异的核苷酸及其应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种对克罗诺杆菌O抗原基因簇特异的核苷酸，尤其涉及一种对克罗诺杆菌O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸。

背景技术

Cronobacter（克罗诺杆菌）是最近新分类的一个属，原称Enterobactersakazakii（阪崎肠杆菌）。2007-2008年由种上升为属，成为肠杆菌科的一个新属Cronobacter。目前包括7个种，Cronobacter sakazakii，C.malonaticus，C.muytjensii，C.dublinensis，C.turicensis，C.condimenti和C.universalis。现有研究表明，所有克罗诺杆菌不同菌株之间有着明显的致病性差异，其中和婴幼儿感染相关的菌集中在Cronobacter sakazakii，C.malonaticus和C.dublinensis上。

克罗诺杆菌是重要的食源性致病菌，分布广泛，在婴幼儿奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、面包、茶叶、草药、调味料以及豆腐等多种食品中被检测到。在对一些新生儿克罗诺杆菌感染事件的调查中发现婴幼儿奶粉是主要感染渠道。随着一系列与该菌相关的奶粉召回和重大感染事件的爆发，婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的感染问题受到全世界的普遍关注，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，死亡率可达40％～80%。世界卫生组织（WHO）和美国食品药品监督管理局（FDA）相继在2004年和2006年召开了讨论该菌的会议。

目前克罗诺杆菌的分类地位刚刚建立，其O抗原血清型的研究也逐渐成为热点。脂多糖是革兰式阴性细菌的主要表面成分，包括类脂A，核心多糖和O抗原。O抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖分子的最外层结构，它是由多个寡糖重复单位组成的多糖链，重复单位一般由3～6个单糖组成。在大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌中，负责O抗原合成的基因相邻排列于两个持家基因galF和gnd之间，在染色体上形成一个基因簇。O抗原基因簇内部的基因通常分为三类：单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。单糖合成酶负责单糖前体的合成，糖基转移酶负责将单糖串联成寡糖重复单位，而寡塘单位处理酶负责将寡糖单位从内膜内侧转运到内膜外侧，并将寡糖单位进行串联。

脂多糖特别是其中的O-抗原的组成和结构的变化决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性，比如国际上根据脂多糖的结构特性而鉴定过沙门氏菌属的抗原类型多达2107个。血清分型是一种经典和常用的流行病学调查手段，对于临床研究及疫苗研制具有重要意义。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的O抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此,建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为目前的发展方向。现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于阪崎肠杆菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

不同抗原的糖基转移酶和寡糖单位处理酶的序列同源性很低，具有高度的血清型特异性，可用作靶基因进行分子生物学鉴定。寡糖单位处理酶基因包括O抗原转运酶基因(wzx)和O抗原聚合酶基因(wzy)。利用上述两个基因作为血清型分型检测的特异靶基因是十分理想的。如大肠杆菌（王威，彭霞，2006年）、变形杆菌和沙门氏菌均有利用该基因做特异检测的实例。