[发明专利]一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法

权利要求书

1.一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）急性细胞分离：（a）将成年豚鼠麻醉后快速取出心脏放置于4 C°含钙液中去除心包，找出主动脉然后挂于灌注装置上开始心脏逆向灌注，先用含钙液灌流2min，然后用无钙EGTA 液灌流5min，再用酶解液循环灌流8-10min，再用酶洗脱液灌流5min；（b）剪下心室肌组织放入无菌培养皿并切碎，（c）将切碎的心室肌组织加入酶洗脱液中，在37°C下用自动摇晃机进行机械性分离5-10min得到细胞悬浮液（d）将细胞悬浮液用200目的尼龙纱布过滤，所得滤液中的心室肌细胞准备下一步培养；其中，所述含钙液为：300ml灌流母液中加入CaCl₂至Ca²⁺ 浓度为750μmol/L ；所述无钙EGTA 液为：300ml灌流母液中加入EGTA至EGTA浓度为3.3μmol/L；所述酶解液为：80ml灌流母液中加入CaCl₂、粗胶原酶和蛋白酶，使Ca²⁺ 浓度为100μmol/L、粗胶原酶浓度为1mg/ml、蛋白酶的浓度为0.1 mg/ml；所述酶洗脱液为：220ml灌流母液中加入CaCl₂至Ca²⁺ 浓度为100μmol/L；所述灌流母液用超纯水配制，其中含有：130 mmol/L NaCl，23 mmol/ L 4- 羟乙基哌嗪乙磺酸，21 mmol/L 葡萄糖，20 mmol/L 牛磺酸，5 mmol/L 肌酸，5 mmol/L MgCl₂，5 mmol/L 丙酮酸钠，4.5 mmol/L KCl，1 mmol/L NaH₂PO₄，pH 为7.3；（2）铺细胞：取步骤（1）得到的心室肌细胞离心后放入培养基中，用细胞计数器计算出心肌细胞密度，铺在培养皿上的细胞密度应控制小于10⁴个正常杆状细胞/ cm^?2；（3）更换培养液：在细胞铺后4小时之内每隔30 min慢慢更换培养液，取出死细胞，4小时之后，每3天换一次培养液。

2.根据权利要求1所述的一种成年豚鼠心脏分离细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）所述培养基包括碳酸氢盐缓冲液和通用添加剂，所述碳酸氢盐缓冲液含有1.8mmol/L CaCl₂，116 mmol/L NaCl，0.6 mmol/L 醋酸钠，1 mmol/L NaHPO₄，5.3mmol/L KCl，0.8 mmol/L MgSO₄；所述通用添加剂包括5 mmol/L 肌酸，5mmol/L 牛磺酸，2mmol/L左旋肉碱，2.5 mmol/L 丙酮酸，10^?7 mmol/L胰岛素和体积浓度是1%的胞嘧啶-β-D-呋喃阿拉伯糖苷。

3.根据权利要求1所述的一种成年豚鼠心脏分离细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）所述培养皿用层粘连蛋白液覆盖于表面至少30分钟，所述层粘连蛋白液用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为1–5μg /ml。