[发明专利]一种海藻酸裂解酶SHA-2基因及其表达载体

说明书

本发明公开了一种海藻酸裂解酶SHA‑2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明构建了海藻酸裂解酶基因SHA‑2的原核表达载体，该原核表达载体能够在较短时间内获得表达产物海藻酸裂解酶SHA‑2，且具有广泛的底物特异性，既能利用聚甘露糖醛酸（Poly‑mannuronate，PolyM）也能利用聚古罗糖醛酸（Poly‑guluronate，PolyG）为底物，酶活达到5.2U/mg，是一种具有广泛应用前景的双功能酶，本发明原核表达载体和整体表达系统容易操作，便于工业化生产。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种海藻酸裂解酶SHA-2基因及其原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-2，该载体高效表达海藻酸裂解酶蛋白SHA-2。

背景技术

近年来海洋资源的开发利用已逐渐成为研究的热点，海藻酸因其独特的理化性质在食品、医药和化工等领域具有广泛的应用前景。海藻酸寡糖因具有多种生理活性，成为开发新药的聚焦点。同时海藻酸作为最丰富的海洋生物质之一，因具有以下优势：（1）光合作用效率高，生长快，产量高，资源丰富；（2）生长不占用耕地；（3）几乎不含有木质素，纤维素的含量少，预处理简单，便于微生物的利用和发酵；从而在生物能源领域受到了广泛的关注。目前，降解海藻酸的方法可分为三大类：第一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸。第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一的酶制剂或使用不同底物专一性组合的酶制剂。

海藻酸裂解酶主要由海藻酸分解菌和一些海洋动植物等产生，具有很大的应用前景。但野生型海藻酸分解菌产酶量低且成本高，很难达到实际的应用要求。因此，通过基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。1993年，Boyd等首次克隆了Pseudomonas alginovora海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌中进行了表达，其粗酶液活性达到146U/mg。1996年Frederic等将Pseudomonas alginovora中编码海藻酸裂解酶的基因aly在大肠杆菌中表达，其催化活性达到97U/mg。2009年，Gaofei Duan等人在Pseudoalteromonas sp. CY24中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，并在大肠杆菌中进行表达，得到一个催化活性为121.6U/mg，分子量为58KD的蛋白。2012年，Hwan Hee Park等利用Sphingomonas sp. MJ-3的基因组构建基因文库，筛选得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并将其在大肠杆菌中表达，得到了一种对polyM 和polyG都有活性的双功能酶。

发明内容

本发明目的是提供一种海藻酸裂解酶SHA-2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本海藻酸裂解酶SHA-2基因来源于厌氧海藻酸分解菌Marinicatena alginatilyticaSH-52（保藏编号为CCTCC NO：M2013073），由本实验室全基因组测序获得，通过BLAST比对，结果显示与Zobellia galactanivorans strain DsiJT的海藻酸裂解酶亲缘关系相似度为74%。